| 研究課題/領域番号 |
15J10131
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
小林 正弥 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| キーワード | テルペノイド / アルカロイド / プレニル基転移酵素 / 生合成 / 放線菌 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、放線菌の生産する生物活性物質であるプレニルインドールアルカロイド（カルキノスタチンA, Bおよびラバンドキノシン）の生合成マシナリーを明らかにすることにより、微生物を利用した医薬品リード化合物の効率的な生産や新規有用化合物の創製に取り組むことを目的としている。本年度は、以前に同定したSqualene synthase-likeな新規のプレニル基転移酵素（CqsB4）の機能解析、およびシクロラバンデュリルジリン酸合成酵素（CLDS）のX線結晶構造解析を実施した。
CqsB4の基質を同定するため、cqsB4遺伝子破壊株を作製しその培養抽出物を分析した結果、カルキノスタチンAのイソプレノイド側鎖が失われたカルバゾール化合物4を単離・構造決定することができた。そこでCqsB4の組換えタンパク質を化合物4およびDMAPPと反応させたところ、その反応産物からカルキノスタチンAの生成が確認できた。このことから、CqsB4は化合物4にジメチルアリル基を転移することで、カルキノスタチンA生合成の最終段階の反応を担っていることが明らかとなった。さらに化合物4およびDMAPPを基質として、CqsB4の動力学的パロメーターを算出した。
加えて、ラバンドキノシンの生合成に関与すると予想されるシクロラバンデュリル2リン酸合成酵素（CLDS）のX線結晶構造解析に取り組んだ。その結果、セレノメチオニン置換体タンパク質の回折データをもとにCLDSの構造を決定することができた。今後、その立体構造情報に基づいた生化学的解析を進めることで、CLDSの触媒する2分子のDMAPPの縮合と環化の反応機構に関する知見が得られると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
プレニル基転移酵素CqsB4の基質となる生合成中間体の同定に成功し、カルキノスタチンA生合成における本酵素の機能を明らかにすることができたため。また平成28年度研究計画に記載したCLDSの構造の解明を本年度達成することができたことから、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
カルキノスタチンA生合成遺伝子クラスターに存在する機能未知遺伝子の酵素学的解析を進め、カルバゾール骨格形成機構の全容解明を目指す。また、CqsB4を含む各酵素の構造解析に取り組み、基質特異性や触媒機構に関する情報を取得する。
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