| 研究課題/領域番号 |
15J40150
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
矢野 佳芳 新潟大学, 医歯学総合研究科, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2015-10-09 – 2019-03-31
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| キーワード | quaking / RNA結合蛋白質 / グリア / オリゴデンドロサイト / ノックアウトマウス |
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| 研究実績の概要 |
＜Qk-floxマウスの作製＞
Qkコンディショナルノックアウトマウス(cKO)を作製するため、申請者らはこれまでにQk遺伝子のexon2をflox配列で挟んだQk-floxマウスを作製した(脳研究所細胞神経生物学分野による包括脳モデルマウス作製支援)。昨年12月に凍結胚(F0世代)の融解移植を行い、動物施設にマウスの導入を行った。産仔の中にQk-floxヘテロマウスを得ることはできたが、残念ながらneo耐性遺伝子が除かれたマウスがいなかったため、現在、Actb-FLPeマウスと交配しneo耐性遺伝子の除去を行っている。
＜マウス神経系におけるQk蛋白質の発現解析＞
Qk蛋白質はQk-5, Qk-6, Qk-7と選択的スプライシングにより３つの異なるアイソフォームが知られている。そこで、各々に特異的な抗体を用いて免疫染色を行い、発生期神経系におけるQk蛋白質の発現パターンを詳細に解析した。Qk-5は胎生10.5日目にはすでに未分化神経前駆細胞の存在する脳室帯(VZ)に強い発現が見られ、nElavls陽性のニューロン前駆細胞では発現が減弱し、ニューロンに運命決定してゆく過程で発現が抑制されることがわかった。一方でQk-6, Qk-7は発現が弱いかもしくは検出感度以下であった。その後、胎生13.5日目にはVZだけでなく、Olig2陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)およびNova1/2陽性の分化したニューロンの一部にもQk-5が発現することを明らかした。胎生13.5日目にはQk-6がSZおよびOPCに発現が強く見られた。Qk-7は発現開始時期が遅いながらもQk-6と似たパターンであった。よって、神経前駆細胞ではQk-5が強く発現し、オリゴデンドロサイトへ分化していく過程で、Qk-6, Qk-7が優位になっていく発現のスイッチングが起きていることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H27年10月より本研究を開始し、半年が経過した。Qk-floxマウスの作製については、100%キメラの凍結胚を仮親に移植を行ったところ、産仔数が少なく、当初の予定より数ヶ月遅れがあった。しかしながら、年度内にF0世代を得ることができ、現在はActb-FLPeマウスと掛け合わせneo耐性遺伝子を除去する段階まで進んでいるので、やや遅れが見られたものの、概ね順調に進んだと言える。さらに、その間に、神経系におけるQk蛋白質の発現についてアイソフォーム特異的な抗体を用いて詳細に調べ、Qk-5, Qk-6, Qk-7の異なる発現パターンを知ることができ、今後の研究のベースとなるデータを得ることができたため、一定の評価ができると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜Qkの神経系におけるRNA制御機構の解析＞
Qk-flox;neo(-)マウスが得られ次第、神経系および細胞種特異的なCreドライバーマウスとQk-flox;neo(-)マウスを掛け合わせてQkコンディショナルノックアウトマウス(cKO)を作製する。RNA-seq法によりQk蛋白質の標的RNAの網羅的解析およびマウス脳を用いた組織学的な解析により表現型解析を行っていく予定である。Qk-5は特に神経前駆細胞、Qk-6, Qk-7はオリゴデンドロサイトでの機能に注目し、今後研究を展開していく。
また、既報のRibo-tagマウスをJackson labより購入し、胚操作を経て動物施設に導入する手続きを進めており、細胞特異的トランスクリプトーム／トランスレイトーム（網羅的翻訳）解析を行う予定である。H28年6月にはマウスが交配可能となる見込みであり、H28年度の後半に解析を行う。さらにQk依存的な細胞特異的RNA発現制御メカニズムを明らかにするために、次世代の細胞特異的、時期特異的かつ高解像度RNAマッピング解析技術に繋がる新しいHITS-CLIP法の確立を共同研究ベースで進めている。
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| 備考 |
HITS-CLIP法; トランスクリプトームワイド 蛋白質-RNA相互作用のin vivoフットプリンティング 矢野 真人、矢野 佳芳（新潟大学大学院医歯学総合研究科神経生物・解剖学分野）
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