| 研究課題/領域番号 |
15K00412
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
伊藤 將弘 立命館大学, 生命科学部, 教授 (50388112)
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| 研究分担者 |
亀村 和生 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (00399437)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | O-GlcNAc転移酵素 / 進化トレース / 活性部位 / ドッキングシミュレーション / 点突然変異 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は，O-GlcNAc転移酵素の機能獲得について生物種横断的な解析を進化トレース法を用いて行った．即ち，O-GlcNAc転移酵素の機能部位の予測と比較を行うために，O-GlcNAc転移酵素活性を持っている種としてヒトおよびシロイヌナズナ，それ以外としてAureococcus anophagefferensおよびプロクロロコッカスを用いた．進化トレース解析の結果，UDP-GlcNAcが結合する領域のアミノ酸が種間で進化的に保存されていないことを確認した．次に，この領域のアミノ酸について立体相補性，静電相補性および疎水相補性についてさらに解析を行ったところ，UDP-GlcNAc結合部位はヒト，シロイヌナズナおよびプロクロロコッカスにおいて類似していたが，A. anophagefferensでは3つの種より電気的に負に帯電していたことを見出した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
O-GlcNAc転移酵素（OGT）は，後生動物や植物において機能する．一方，それ以外の生物においてもOGTに類似した配列のタンパク質は存在するが，機能は未知である．そこで本研究では進化トレース法を用いてOGTの解析を行い，予測されるOGTの活性部位を比較することでOGTが機能を獲得する過程の解明を試みた．
その結果，生物種間においてUDP-GlcNAcが結合する部位付近のアミノ酸は保存されていないことが確認された．そのため，結合部位付近のアミノ酸の違いがUDP-GlcNAcとの結合にどのような影響を与えているか解析をするために，CDOCKERを用いたドッキングシミュレーションを行い結合自由エネルギー⊿GおよびUDP-GlcNAcの結合様式について解析を行った．CDOCKERの解析でそれぞれの⊿Gはヒト-8.94 kcal/mol，シロイヌナズナ-7.08kcal/mol，アウロコッカス35.68kcal/mol，プロクロロコッカス-594.84kcal/molであった．また，UDP-GlcNAcの結合様式はヒト，シロイヌナズナ，プロクロロコッカスでは類似していたが，アウロコッカスのみ異なる結合様式であった．ヒトとプロクロロコッカスの結合様式は類似していたが⊿Gに大きな差が見られた．これはプロクロロコッカスのリジンがヒトではトレオニンに変異したためである．従って本研究では，アミノ酸変異により立体構造が変化したため⊿Gが大きくなり，ヒトやシロイヌナズナでは，O-GlcNAc転移酵素の活性を獲得したことを示唆した．
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度以降も，（１）ID領域におけるO-GlcNAc修飾の配列解析，（２）O-GlcNAc修飾とリン酸化における天然変性タンパク質の分子動力学シミュレーションと生命情報から行い，その理論を証明するために，従来の分子生物学やオミックス研究を通して，O-GlcNAc修飾の同定を行う．
具体的には，以下の通りである．
（１）O-GlcNAc修飾残基におけるID領域と非ID領域（構造領域）におけるアミノ酸配列や組成の相違を解析する．
（２）分子動力学を用いて，天然変性タンパク質の変性領域でO-GlcNAc修飾とリン酸化の有無を検証する．しかし，配列情報からの構造予測は可能であるが20残基以上の予測は制度が悪い．そこで，O-GlcNAc修飾とリン酸化の領域に注目して解析をAmberやCHARMMなどを用いて進める．
（３）時空間的なO-GlcNAc修飾タンパク質，ならびに修飾部位の同定を線虫C. elegansとヒト，あるいはマウスの培養細胞で行う．O-GlcNAc修飾は，質量分析ではエレクトロスプレーイオン化の際にO-GlcNAc残基が高頻度に遊離してしまうので，修飾部位同定が困難な場合が多い．そこで，O-GlcNAc修飾タンパク質であることが同定されたものをリストアップし，これらについてO-GlcNAc残基に分子量の大きいタグ（mass-tag）を付加させてウエスタンブロットすることで，ポリユビキチン化のようなラダー状バンドに検出され，そのサイズと数から修飾残基数や修飾ドメインを特定する．
これら生命情報学と分子生物学やオミックス解析を相互に取り入れることで，O-GlcNAc就職の規則性と機能を解明する．
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