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2016 年度 実施状況報告書

実用的なポリ塩化ビフェニルを分解する芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの創製

研究課題

研究課題/領域番号 15K00590
研究機関京都学園大学

研究代表者

櫻間 晴子  京都学園大学, バイオ環境学部, 講師 (90456426)

研究分担者 高塚 由美子  山形大学, 大学院理工学研究科, 助教 (70570810) [辞退]
乾 秀之  神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (90314509)
原 富次郎  山形大学, 大学院理工学研究科, 教授 (70616193) [辞退]
研究期間 (年度) 2015-10-21 – 2018-03-31
キーワードポリ塩化ビフェニル / 芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ / 環境浄化
研究実績の概要

本研究では高塩素化ポリ塩化ビフェニル類(PCB)に対して高分解性を示す芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体酵素の創製を目指すことを目的とする。昨年度のComamonas属由来の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体解析の結果から、6塩素以上の高塩素化PCBに作用する酵素の創製は当初予想していたよりも困難であると考えた。そこで、本年度は当初の計画を変更し、下記2点の実験を実施した。
(1)3種類の候補遺伝子の大腸菌発現系の構築
高塩素化PCBを分解する酵素を得るためには、Comamonas属由来の多重変異体酵素よりも他の酵素を試すことが有効であると考えた。本年度はComamonas属由来の酵素以外の可能性について検討することにした。そこで、Comamonas属由来の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとは構造が異なるために基質特異性が異なると推定される酵素を3種類選択し、候補酵素とした。それらのうち、1種類の酵素については単離し、その発現条件を検討した。その結果、発現ならびに活性が検出されたが、今後はよりよい発現条件が必要だと考える。また、残り2種類の酵素については人工的に合成した遺伝子を発現ベクターに組み込み、その発現条件を検討しているところである。
(2)PCB分解活性の評価系の改良
これまでは、PCBの分解活性は、親化合物である残存PCB量を検出することにより行っていた。この場合、分解活性が弱いと、親化合物の減少はわずかであるために検出できない可能性が考えられる。そこで、活性が弱くても検出できるように、代謝産物を検出する系を検討しているところである。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、候補の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ遺伝子をコードする発現ベクターを3種類準備し、現在、発現条件を検討しているところまで進んだ。よって、違った種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを準備できたためより改変できる可能性を広げたと言える。さらに、別の検出系を検討したことは、活性が弱くても検出できる可能性を高めたと言える。この2点のことから、研究進展状況は順調であるといえる。よって、今後は、より高塩素化されたPCB異性体に作用し、カネクロールKC-500に対して高い分解効率を有する芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを取得することが課題である。

今後の研究の推進方策

本年度準備した3種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼについて、下記の実験を行う予定である。
(1)PCBに対する分解特性の解析
本年度に引き続き、大腸菌での発現条件を検討する。発現を確認した酵素に関してPCB分解特性を解析する。
(2)変異体解析
(1)で有望であると分かった酵素に対して、PCB複合体の推定構造を基に基質結合部位ならびにその周辺部位を候補として変異体解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

試薬などの消耗品費が当初の予定よりも少額で済んだことによる。

次年度使用額の使用計画

本年度は、構築した3種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼについて変異体解析を行うことを計画しており、そちらに使用する予定である。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 5件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Structural determinants for the position of 2,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyl (CB118) hydroxylation by mammalian cytochrome P450 monooxygenases2016

    • 著者名/発表者名
      Mise, S., Haga, Y., Itoh, T., Kato, A., Fukuda, I., Goto, E., Yamamoto, K., Yabu, M., Matsumura, C., Nakano. T., Sakaki, T., and Inui, H.
    • 雑誌名

      Toxicological Sciences

      巻: 152 ページ: 340-348

    • DOI

      https://doi.org/10.1093/toxsci/kfw086

    • 査読あり
  • [学会発表] 微生物由来P450モノオキシゲナーゼによるPCBの代謝に影響を及ぼす有機フッ素化合物2017

    • 著者名/発表者名
      乾秀之
    • 学会等名
      第13回PCB講演会
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2017-01-19 – 2017-01-19
    • 招待講演
  • [学会発表] デコイ分子を用いたBacillus megaterium由来シトクロムP450モノオキシゲナーゼによるCB118の代謝とその構造基盤2016

    • 著者名/発表者名
      後藤絵里香、乾秀之
    • 学会等名
      若手フロンティア研究会
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2016-12-21 – 2016-12-21
  • [学会発表] Aerobic toluene/biphenyl degradation genes in the denitrifying bacterial Thauera sp. starain DNT-12016

    • 著者名/発表者名
      Kosuke Kawaguchi, Haruko Sakurama, Mitsuru Katayama, Junya Akagi, Yoshifumi Shinoda, Hiroya Yurimoto, Yasuyoshi Sakai, Nobuo Kato
    • 学会等名
      第9回国際PCBワークショップ(共催:日本環境化学会、Iowa superfund research program)
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2016-10-09 – 2016-10-13
    • 国際学会
  • [学会発表] Structural determinants of species differences on metabolism of dioxin-like polychlorinated biphenyls by mammalian cytochrome P450 monooxygenases2016

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Inui, Yuki Haga, Toshimasa Itoh, Erika Goto, Keiko Yamamoto, Chisato Matsumura, Takeshi Nakano, Toshiyuki Sakaki
    • 学会等名
      第9回国際PCBワークショップ(共催:日本環境化学会、Iowa superfund research program)
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2016-10-09 – 2016-10-13
    • 国際学会
  • [学会発表] Metabolic fates of CB118 by cytochrome P450 monooxygenase from soil bacterium under complex pollution and its structural basis2016

    • 著者名/発表者名
      Erika Goto, Yuki Haga, Makoto Kubo, Toshimasa Itoh, Chie Kasai, Osami Shoji, Keiko Yamamoto, Chisato Matsumura, Takeshi Nakano, Hideyuki Inui
    • 学会等名
      第9回国際PCBワークショップ(共催:日本環境化学会、Iowa superfund research program)
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2016-10-09 – 2016-10-13
    • 国際学会
  • [学会発表] Enantioselective metabolism of chiral polychlorinated biphenyls by rat and human cytochrome P450 monooxygenases2016

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Inui, Chiharu Miwa, Shintaro Mise, Erika Goto, Yuki Haga, Chisato Matsumura, Takeshi Nakano, Toshiyuki Sakaki
    • 学会等名
      The 13th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity & Biotechnology
    • 発表場所
      Vancouver, Canada
    • 年月日
      2016-07-22 – 2016-07-26
    • 国際学会
  • [学会発表] Structural basis of CB118 metabolism by cytochrome P450 monooxygenase from Bacillus megaterium with decoy molecules2016

    • 著者名/発表者名
      Erika Goto, Yuki Haga, Makoto Kubo, Toshimasa Itoh, Chie Kasai, Osami Shoji, Keiko Yamamoto, Chisato Matsumura, Takeshi Nakano, Hideyuki Inui
    • 学会等名
      The 13th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity & Biotechnology
    • 発表場所
      Vancouver, Canada
    • 年月日
      2016-07-22 – 2016-07-26
    • 国際学会
  • [学会発表] デコイ分子を用いたBacillus megaterium由来シトクロムP450モノオキシゲナーゼによるCB118の代謝とその構造基盤2016

    • 著者名/発表者名
      後藤絵里香、羽賀雄紀、久保惇、伊藤俊将、笠井千枝、荘司長三、山本恵子、松村千里、中野武、乾秀之
    • 学会等名
      第25回環境化学討論会(日本環境化学会)
    • 発表場所
      新潟
    • 年月日
      2016-06-08 – 2016-06-10

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公開日: 2018-01-16  

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