| 研究課題/領域番号 |
15K00842
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| 研究機関 | 聖徳大学 |
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研究代表者 |
横山 嘉子 聖徳大学, 人間栄養学部, 准教授 (40202395)
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| 研究分担者 |
加納 和孝 聖徳大学, 人間栄養学部, 教授 (70111507) [辞退]
神野 茂樹 聖徳大学, 人間栄養学部, 教授 (10251224)
田部井 功 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (50266649)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | エライジン酸 / インスリン抵抗性 |
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| 研究実績の概要 |
トランス脂肪酸の摂取によりインスリン抵抗性のリスクが増加することが知られているが、その詳細な生化学的解析は行われていない。本研究ではいくつかの系を用いてトランス脂肪酸の影響を検討し、その機構を明らかにすることにより、臨床栄養学的にインスリン抵抗性に対する予防措置を具体化することを目的とする。平成27年度では主に以下の2点を行った。
1．エライジン酸のTLR4を介したIR、IRSのリン酸化への影響
エライジン酸が細胞膜に存在するTLR4を介してYMB細胞でIL-6、TNF-αの発現・分泌を促し、細胞内情報伝達系を駆動していることを報告した。STAT3あるいはJNKはIRSのセリンリン酸化を亢進することが報告されている。IR、IRSのリン酸化を指標としてTLR4、STAT3、JUNKそれぞれの阻害剤、TAK-242、HO-3867、SP600125の効果を解析した結果、これら阻害剤はいずれもエライジン酸によるIRSのセリンリン酸化を阻害した。このことはエライジン酸がTLR4を駆動してインスリン抵抗性を惹起していることが今回の研究で明らかとなった。これらの結果は、TLR4情報伝達系を阻害することによりエライジン酸によるインスリン抵抗性発症を制御できる可能性を示すものである。
2．揚げ物料理によるトランス脂肪酸の生成
揚げ物料理に用いられるステンレス鍋には不飽和脂肪酸の部分水素化において触媒として用いられてニッケルを多量に含むものがある。今年度の実験ではトランス脂肪酸の生成原因と考えられているニッケルを40%含む鍋と殆ど含まない鍋を用いてトランス脂肪酸が生成するか、オレイン酸を多量に含むオリーブ油を用いて検討した。いずれの鍋でも180℃以下ではトランス脂肪酸の生成は認められなかったが、ニッケルを含む鍋では200℃での調理ではわずかではあるがトランス脂肪酸の生成が認められた。現在、詳しく解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までに研究はおおむね順調であるが、いくつか問題が生じている。一つはYMB細胞の性質に変化が起こりエライジン酸によるアディポネクチン発現抑制あるいはTNF-α発現の低下が生じてきた。またGLUT4の発現にも変化が起き始めている。そこでヒト単球由来白血病細胞U937とマウス胎児繊維芽細胞3T3-L1を代替導入して実験を継続している。前者を用いた研究ではエライジン酸によるTNF-α発現の減少などを認めており、平成28年度計画に記したエライジン酸の情報伝達経路についての解析が可能であると考えている。現在までにエライジン酸によりTNF-α、IL-6、接着分子ICAM-1、さらに好酸球遊走因子エオタキシンなどの発現が亢進することが確かめている。現在いくつかの阻害剤を用いてエライジン酸のTLR4を介した情報伝達系の解析を進めている。後者の細胞の培養液に 3 種類の薬剤、IBMX、インスリン、 デキサメタゾンを添加すると、Adipocyte-like 細胞へと分化することが知られている。Adipocyte-like 細胞ではGLUT4の発現・細胞膜移行が認められることが報告されている。申請時の平成28年度の計画にも記したようにリアルタイムPCR、たんぱく質二次元電気泳動、ウェスタンブロッティングなどの手法を用いて、エライジン酸によるGLUT4の発現・細胞膜移行への影響について解析を開始している。以上のように細胞の変更は行ったが、全体として進捗状況に大きな変更は無い。GLUT4の細胞膜移行の解析には共焦点顕微鏡を用いた解析も予定している。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請者らのこれまでの研究によってエライジン酸はTLR4をその受容体として細胞に炎症性変化を惹起し、TNF-α、IL-6、ICAM-1などの様々なサイトカイン、接着たんぱく質などの発現の異常、あるいはマクロファージの食作用の亢進などを引きおこすことが明らかになった。今後は上記のタンパク質を指標にRT-PCR、ウェスタンブロッティング、二次元電気泳動などの手法を用いてエライジン酸によるTLR4を介した細胞内情報伝達系の流れを詳細に解析し、その機構を明らかにすることにより、臨床栄養学的にトランス脂肪酸によるインスリン抵抗性に対する予防措置を具体化する。また抗炎症作用を持つことが明らかになっている、DHA、EPAなどがTLR4情報伝達系にどのような作用を持つかについても詳しく検討してインスリン抵抗性の防御と予防に役立てることを目的とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度にYMB細胞を用いてエライジン酸によるインスリン情報伝達系への影響を解析する予定であったが、YMB細胞の性質に変化が起こり反応性の低下が生じてきたため計画を変更し、U937細胞と3T3-L1細胞を導入して実験を継続した。GLUT4の細胞膜移行を指標とする解析からTLR4を介した炎症性サイトカインなどの情報伝達系の解析を行なう予定であったが、3T3-L1細胞はマウス由来であるためにプライマー、抗体などをマウス用のものも作成しなければならず、そのための準備期間があり未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究の進展に伴い、次年度には共焦点顕微鏡・フローサイトメーターを用いてGLUT4の発現、細胞膜移行の解析を行うことを計画している。当初の予定とは異なり、これら実験に用いる蛍光抗体その他が必要となってきた。そのために細胞培養の培地、血清、RNA 抽出kit, サイトカイン関連遺伝子のプライマー、RT-PCR試薬など昨年とほぼ同様の経費を見込むと同時に、新たにGLUT4をはじめとしていくつかの指標たんぱく質に対する、蛍光抗体を購入する必要が出てきている。
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