| 研究課題/領域番号 |
15K00844
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
染谷 明正 順天堂大学, 医学部, 准教授 (90167479)
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| 研究分担者 |
長岡 功 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60164399)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | グルコサミン / 抗炎症 / O-GlcNAc修飾 / NF-κB / p65 |
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| 研究実績の概要 |
グルコサミンには抗炎症作用があることが知られているが、その詳細は不明である。本研究課題では、グルコサミンでおこるタンパク質の糖化修飾[O-N-アセチルグルコサミン修飾（O-GlcNAc修飾）]がグルコサミンの炎症抑制作用にどのように関与しているか、そのメカニズムの解明を目指している。特に炎症惹起に深く関わるNF-κB（転写因子）やp38MAPK（シグナル伝達分子）に着目して研究を遂行している。
平成27年度の研究結果から、ヒト滑膜細胞株MH7Aにおいて、NF-κBが炎症性刺激剤IL-1βで活性化されることが確認できたので、現在NF-κBを中心にp38MAPKについても研究を進めている。
平成28年度では、免疫沈降法でp65（ヘテロ2量体であるNF-κBのサブユニット）とp38MAPKを精製し、それらのO-GlcNAc修飾状態に対するグルコサミンの影響を調べた。その結果、p65はグルコサミンでO-GlcNAc修飾され、それはOGT（O-GlcNAc修飾酵素）阻害剤で抑制されることが確認された。一方、p38MAPKのO-GlcNAc修飾は確認できなかった。現在、p65のO-GlcNAc修飾部位の同定を質量分析法で試みている。また質量分析の結果から、p65とinteractionするタンパクとして、p105/p50（もう一つの2量体NF-κBサブユニット）とIκB（NF-κBの抑制分子）が検出された。現在、各分子（p65、p105/p65、IκB）のO-GlcNAc修飾を受けるアミノ基の同定と、グルコサミンによる各分子のinteractionが変化するのか、ならびにタンパクinteractionとO-GlcNAc修飾との関係の解明を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究計画では、質量分析法でO-GlcNAc修飾部位を決定し、in vitroでの解析を進めるとともに、動物を用いたin vivo解析を開始している予定である。しかし、免疫沈降法の確立や、質量分析法によるO-GlcNAc修飾部位の同定に時間がかかり、遅れが生じている。一方、p65とinteractionするタンパク質が同定された。そしてグルコサミンが、p65とこれらタンパクとのinteractionを変化させる可能性が出てきた。
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| 今後の研究の推進方策 |
p65においてO-GlcNAc修飾を受けるアミノ酸残基の同定を継続する。またNF-κBのp50サブユニット、およびIκBがGlcNでO-GlcNAc修飾を受けるのか、修飾されるならそのアミノ酸残基を同定する。また、GlcN処理による各タンパク質のinteractionの変化、およびO-GlcNAc修飾との関わりを免疫沈降法や阻害剤の効果ならびに、O-GlcNAc修飾を変える変異体を用いて調べる。さらに、これらの結果をもとに動物を用いたin vivo実験へと発展させたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
p65とp38MAPKを免疫沈降するための抗体の決定とその実験条件検討に時間を要した。また質量分析法によるO-GlcNAc修飾基の検出が予想以上に難しく時間を要している。そのため、遺伝子導入実験に必要なベクター、試薬ならびに、消耗品等の購入経費を次年度に持ち越すことになった。また動物実験に必要な経費も持ち越すことになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
NF-κBや、その調節タンパク質を免疫沈降・検出するための抗体の購入、質量分析の費用、タンパク質変異体の作製・導入のための費用ならびに、動物の購入・維持の費用に使う予定である。また、研究成果を発表するための学会参加費用に充てる予定である。
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