研究課題
ヒトES細胞やヒトiPS細胞などの多能性幹細胞は、疾患のある組織を健康な組織で置き換える再生医療において、その細胞供給源になると期待されている。本計画では、自然に未分化性が破綻する状況を再現した実験系で見いだされた２つのエピジェネティック遺伝子（ポリコーム遺伝子群に属するMBTファミリー遺伝子）に焦点をあて、特に未分化－分化の境界における機能を解析する。予備的な研究として、未分化状態が自然に破綻する不安定な培養条件を細胞形態と未分化マーカーの発現を指標に確立し、そのときの細胞の状況をマイクロアレイによって解析した。その結果、明白な分化までは至っていないが、未分化性が不安定になっている状態を人工的に作り出すことに成功し、そこで特異的に発現変化する遺伝子を多数同定した。その中の２つ（L3MBTL1とSFMBT2）がポリコーム遺伝子郡に含まれる遺伝子であった。ポリコームは多能性幹細胞で発現していて、分化関連遺伝子の発現を抑制することで未分化状態を維持しているのが一般的と考えられており、分化（あるいは不安定化）において発現し、その過程で働いているポリコーム遺伝子はほとんど知られてない。そこで、ヒト多能性幹細胞の未分化－分化（不安定化）間の移行において、PRC1のターゲットが変化するかという点を中心に、不安定化におけるL3MBTL1とSFMBT2の役割について解析を始めた。まず、L3MBTL1とSFMBT2の抗体を準備して、不安定化した多能性幹細胞の免疫染色によって、RNAレベルでの発現変動の確認を行った。そして、ChIP解析によってL3MBTL1とSFMBT2のターゲットとなっている遺伝子の同定と確認を行っている。そして現在、ChIP-Seq 解析によって、未分化なヒト多能性幹細胞と不安定化した多能性幹細胞におけるターゲット遺伝子を網羅的に同定する実験を進めている。
3: やや遅れている
２７年度ではL3MBTL1とSFMBT2のChIP-Seq 解析を目標にしているが、まだ完了してない。この実験では抗体の善し悪しに大きく左右されるために、そのチェックに予測困難な時間を要する。今年度は免疫染色によるチェックに時間を要した。
L3MBTL1とSFMBT2のChIP-Seq 解析の完了を急ぐのが第一である。この解析によってL3MBTL1とSFMBT2のターゲット遺伝子を推定し、それらの発現をリアルタイムPCRで解析する。さらに、IP-Westernによる複合体の確認を行い、どのような複合体がどのような機能を担っているか検討する。そして、その仮説をRNAiによるノックダウンなどを行って検証する。
平成２７年度実施予定のChIP-Seq 解析が完了しておらず、次世代シーケンスの実施を２８年度に延期したため、次年度使用額が生じた。
平成２８年度請求額と合わせて、イルミナ社のMi-seqを用いた次世代シーケンス解析等に使用する予定である。
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http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/medicine/chair/i-1kaibo/
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