| 研究課題/領域番号 |
15K01317
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
小林 純 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (20385404)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 生体材料 / 再生医療 / ハイドロゲル / 温度応答性高分子 / マイクロ流体 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ヘパリン修飾温度応答性表面に増殖因子や接着タンパク質など種々の基底膜成分を温度応答性培養表面上に導入することにより、基底膜を模倣した温度応答性培養表面を調製し、高機能な肝細胞シート作製をおこなう。当該年度は、基底膜を模倣した温度応答性培養表面の作製を行った。カルボキシル基を有する温度応答性表面にヘパリン分子を共有結合させ、ヘパリン修飾温度応答性培養表面を調製した。調製したヘパリン修飾温度応答性培養表面にアフィニティー結合でヘパリン結合性上皮細胞増殖因子様増殖因子（HB-EGF）を導入したのち、ラット初代肝細胞シートの培養およびその機能評価を行った。HB-EGFが培地中に含まれない場合、肝細胞は機能維持できず培養時間の経過にともなって肝細胞の接着細胞数が減少した。一方、HB-EGF結合ヘパリン修飾温度応答性培養表面を用いると、播種したほぼすべての肝細胞が接着し、培養4日後でも接着が維持された。また、温度を45分間20℃に低下することにより、肝細胞シートを回収することができた。さらに、HB-EGF結合ヘパリン修飾温度応答性培養表面上でのアルブミン産生能は、HB-EGF培地添加に比べて約2倍であった。このことから、基底膜成分としてHB-EGFを導入したヘパリン修飾温度応答性表面は、肝細胞シートの機能維持と同時に、温度低下による肝細胞シート脱着を可能とすることがわかった。
柔軟な温度応答性培養表面の作製については、電子線照射法によってPDMS上にpoly(N-isopropylacrylamide)を表面固定化する方法を用いた。シランカップリング剤による前処理を行い、PIPAAm固定化の最適条件を検討したところ、培養温度の37℃における培養細胞の接着性を維持するとともに、温度を20℃に低下させた際、培養細胞が脱着する条件を見出すことができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
基底膜を模倣した温度応答性培養表面の調製と細胞培養に関して概ね予定通り進んでいる。具体的には、基底膜成分としてHB-EGFを導入したヘパリン修飾温度応答性表面を用いて、肝細胞シートの機能維持と同時に、温度低下による肝細胞シートを脱着することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．基底膜を模倣した柔軟な温度応答性培養表面の作製
PDMSあるいは温度応答性ハイドロゲルなどの柔軟な基材表面にヘパリンを導入し、肝特異的機能維持する基底膜成分を導入した温度応答性培養表面を調製する。まず、培養温度37℃における培養細胞の接着性および20℃に低下させた際の細胞脱着性について評価を行う。また、ラット初代肝細胞を培養して肝細胞シート作製およびその機能評価を行う。具体的には、肝細胞培養期間中のアルブミン産生能等の肝特異的機能を測定することで、基材の弾性率が肝細胞に及ぼす影響を検討する。対照としての温度応答性高分子修飾ポリスチレン製基材（弾性率 ～3 GPa）との比較検討もあわせて行う。さらに、コンフルエント濃度で肝細胞を培養表面上に播種し、単層状に培養した後、温度を20℃に低下させることにより、高機能な肝細胞シート組織を作製、回収する。回収した肝細胞シートは、免疫学的組織染色によって解析を行う。
２．温度応答性培養表面の特性解析
上記１．で調製した温度応答性培養表面の特性解析を行う。具体的には、ヘパリン／基底膜成分間のアフィニティーの強さを定量的に解析する。また、柔軟な温度応答性培養基材表面の弾性率を実測する。
３．マイクロ流体デバイスを用いた肝細胞シート培養システム
マスクレス露光装置を利用したフォトリソグラフィーによりマイクロ流体デバイスを作製し、上記で作製した肝細胞シート組織の長期培養およびその評価を行う。具体的には、流体デバイス内部に肝細胞シート組織を留置し、培地を灌流することで、持続的に栄養成分および酸素を供給、老廃物を除去する。さらに、流体デバイスから排出される培地中のアルブミン量をELISAで定量し、肝特異的な機能を持続的に評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画に比べて試薬の購入量が少量で、物品費が当初よりも少額になったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
HB-EGFなどの遺伝子組み換えタンパク質の購入費用に充当する予定である。
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