| 研究課題/領域番号 |
15K01318
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
保住 建太郎 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (10453804)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞外マトリックス / ペプチド / 幹細胞 / スフェロイド / キトサン / インテグリン |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画は幹細胞の培養・増殖に適した細胞外環境の基質特性を、細胞外マトリックスタンパク質(ECM)由来活性ペプチドを用いることで解明し、同定した活性ペプチドを高分子多糖に固定化したES細胞培養用活性ペプチドー高分子多糖マトリックスの開発を目的としている。H28年度は、研究初年度のH27年度から研究を開始したフィブロネクチンの機能を模倣したペプチド-キトサンマトリックスの開発に関しての論文報告を行った。フィブロネクチンは、分子内に多数の活性部位を有する多機能性タンパク質であり、細胞外マトリックスタンパク質の中ではラミニンと並び未分化ES細胞の培養を可能とする基質として利用されている。本報告では、フィブロネクチン中のPRARI配列が、インテグリンα4β1との結合に関与する配列であることを新たに同定した。さらにフィブロネクチンはインテグリンαvβ3およびインテグリンα5β1と結合するRGD配列を有するため、RGD配列含有ペプチドとPRARI配列含有ペプチドを同時に固定化した混合ペプチド-キトサンマトリックスを作製した。混合ペプチド-キトサンマトリックスの作成に関しては、PRARI配列含有ペプチドの長さ、アミノ酸配列の最適化を行った。PRARI最適化ペプチドとRGDペプチドを1:20のモル比で固定化した混合ペプチド-キトサンマトリックスはフィブロネクチンと同程度の細胞接着活性、神経突起伸長活性を示した。本研究成果に関して論文報告を行うと共に学会発表を行った。
また、上記とは異なるインテグリンの組合せを検討したところ、異なるサブタイプのインテグリンーインテグリンクロストークによっても細胞接着活性が促進することが明らかとなった。本結果に関しては、3回の学会発表を行っており、現在は論文投稿の準備を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H28年度は研究計画に沿って以下の４項目の検討を行った。
①フィブロネクチンの機能を模倣した活性ペプチドーキトサンマトリックスの開発、②受容体特異的なECM由来ペプチドを用いたマウスES細胞接着活性ペプチドーキトサンマトリックスの開発、③キトサンゲルの開発、 ④インテグリンサブタイプ特異的結合活性を示す細胞接着ペプチドの組合せの検討
上記、４項目の検討のうち、①―③はH27年度からの継続的な検討課題とし、①はH28年度中に論文掲載された。また、④はH28年度からの新規課題となっている。
②のマウスES細胞接着活性試験では、特異的なインテグリンに結合活性を示すペプチドを固定化したペプチドーキトサンマトリックスを最適化することで、細胞接着活性の向上をもたらすことができた。また、H27年度では、ES細胞継代時にシングルセルまで分散させたときの培養が難しく、コロニー状での培養を行う方向へと計画変更を考慮していたが、③の検討を行う中で、キトサンマトリックスの改良によってシングルセルからの培養を可能とした。現在は、H28年度までに特定した３種類ペプチドを用いて長期培養に向けた最適化を行っている。
④のインテグリンサブタイプ特異的結合活性ペプチドの組合せに関しては、フィブロネクチン由来活性ペプチドとラミニン由来活性ペプチドという由来が異なるインテグリンサブタイプ特異的ペプチドを混合することで接着活性の上昇が見られることがわかってきた。こちらのペプチドを用いたマウスES細胞の培養も開始している。③のキトサンゲルの開発に関しては、Spheroid３D細胞培養に向けての検討を開始した。
以上、現在のところ、課題によって若干の前後は見られるがほぼ研究計画通りに遂行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進方針としては、本研究計画の目的としている混合ペプチドを用いた系での評価とSpheroid形成誘導法開発をすすめていく。マウスES細胞のシングルセルをスタートとした継代から、小塊状のコロニー状マウスES細胞として継代する方法への変更は、H28年度中に行ったキトサンゲルの最適化によって不要となったため、再びシングル細胞継代に戻した上で研究を推進する。活性ペプチドのスクリーニングに関しては、H28年度中に27種類の組成候補から3種類までに絞ったため、今後は3種類の組成候補を様々な割合で混合した混合組成候補とし、マウスES細胞を最長21日間インキュベート培養する。コントロールには市販されているラミニン組換タンパク質とマトリゲルを用いる。未分化維持の確認には21日間培養後に、Oct4、Nanog、SOX2の免疫染色とQ-PCRで評価する。また、安定化したキトサンマトリックスの開発として行っているキトサンゲルの開発にめどが立っていることから、ｐHまたはリゾチーム酵素処理によってSpheroidとしての細胞塊を得る方法の開発を開始する。さらに、キトサンゲルの３D細胞培養への利用に関しては、時間的なロスをなくすためにES細胞培養と並行して他の細胞での検証を行ってきた。H28年度は機能的な3D細胞凝集体の形成が誘導されることがわかっている唾液腺上皮細胞を用いたキトサンゲル上での３D培養において興味深い結果が得られてきた。こちらの検証はマウスES細胞を用いた本研究計画に最大限に結果を反映できるように考慮しながら解析をすすめていく。
以上の研究推進方策のもと、他の細胞なども流用しながらフレキシブルに対応することで、本計画の遂行に向けて研究をすすめていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H28年度は、米国マトリックス学会（11月13日-16日 フロリダ）での成果発表を計画していた。しかし、海外国際学会への参加・発表は長期間の旅程となるために、H28年度は幹細胞長期培養実験の実施を優先し参加を見合わせた。また、代表者本人が発表を行った高分子討論会と日本結合組織学会で、指導している大学院生も成果発表を行った。そのために、海外学会参加予定分の旅費として見積もっていた資金から国内学会での大学院生参加分の旅費を差し引いた額を、次年度への繰り越しとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度は研究計画の最終年度となるために、余裕を持って研究計画を遂行し、得られた結果を海外学会で発表するとともに、論文発表を行うことで、本研究計画で明らかとなった結果を広く社会に報告する予定である。
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