| 研究課題/領域番号 |
15K01401
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| 研究機関 | 関西福祉科学大学 |
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研究代表者 |
森 禎章 関西福祉科学大学, 保健医療学部, 教授 (70268192)
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| 研究分担者 |
山路 純子 (田代純子) 関西福祉科学大学, 健康福祉学部, 准教授 (40340559)
廣島 玲子 関西福祉科学大学, 保健医療学部, 准教授 (40404777)
宮崎 彩子 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (20298772)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 骨格筋 / ミオシン重鎖タイプI / カルシニューリン / IL-6 / イオンチャネル / La3+ / Gd3+ / Ni2+ |
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| 研究実績の概要 |
廃用性筋萎縮において減少する筋線維はタイプI線維であることが知られているが、骨格筋細胞におけタイプI線維の増殖・肥大に関わる因子としてはインターロイキン-6（IL-6）が関与することが報告されている。IL-6は免疫細胞よる分泌されるサイトカインであるが、骨格筋においても運動時など細胞内Ca2+濃度上昇時に骨格筋細胞自身から放出され、オートクライン・パラクラインにより作用することが知られている。この過程において、細胞内Ca2+濃度の上昇によりCa2+依存性脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化され、これが転写因子であるNFATを活性化することでIL-6の転写・産生が増加する。本年度はC2C12細胞に薬剤を投与してカルシニューリン活性化を試み、それぞれの薬剤によるミオシン重鎖タイプI（MyHC I）およびIL-6のmRNA発現量をリアルタイムPCR法により検討した。
IL-6を培養液に添加すると、MyHC IおよびIL-6のmRNA発現量はコントロール条件に比べて有意に上昇した。次に、細胞内Ca2+濃度低下時におけるMyHC IおよびIL-6のmRNA発現量の変化を観察するため、TRPチャネル阻害剤であるLa3+を培養液に投与すると、予想に反して両者のmRNA発現量が有意に増加した。La3+は試験管内においてカルシニューリンをCa2+非依存性に活性化するとの報告が存在するため、カルシニューリン阻害剤であるサイクロスポリンAをLa3+と同時投与したところ、La3+投与によるMHC IおよびIL-6 mRNA発現量の増加が有意に抑制された。さらに、他の多価陽イオンについても検討を加えたところ、Gd3+およびNi2+の培養液への投与においてもMyHC IのmRNA発現量が有意に増加し、これがサイクロスポリンAにより抑制されることが確認できた。したがって、培養液中に投与したLa3+、Gd3+、Ni2+は何らかのイオンチャネルを介して細胞内に流入し、カルシニューリン依存性にMHC IのmRNA発現量を増加させることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、C2C12細胞へのLa3+投与によるミオシン重鎖タイプI（MyHC I）ならびにインターロイキン-6（IL-6）のmRNA増加作用がカルシニューリンの活性化を介しているという研究成果に基づき、C2C12細胞への他の種類の多価陽イオンの作用をリアルタイムPCR法を用いて検討した。この結果、MyHC IのmRNA発現量はGd3+およびNi2+の投与により有意に増加すること、また、IL-6のmRNA発現量に関してはGd3+およびNi2+の投与により有意ではないが上昇する事を確認している。このことは、培養液に投与した多価陽イオンが細胞内に流入して何らかの作用を生じたことを示唆している。La3+は試験管内でCa2+非依存性にカルシニューリンを活性化することが知られているとともに、Ni2+に関しても細胞内Ca2+存在下においてカルシニューリン活性化を促進することが知られているため、多価陽イオンの細胞内への流入によりカルシニューリンの活性化が引き起こされるものと推察された。そこで、これらの多価陽イオンに加えてカルシニューリン阻害剤であるサイクロスポリンを投与すると、MyHC IおよびIL-6のmRNA発現量増加が有意に抑制された。
本年度はこれらの分子生物学的手法を用いた基礎実験に加え、次年度以降に行うパッチ・クランプ実験装置の構築を行った。具体的には、現有のパッチ・クランプアンプであるHEKA社EPC-9はPCIインターフェースボードを介してAplle社PowerMac G4に接続してきたが、老朽化のため動作が不安定でありUSBインターフェース仕様に改修した。さらに、本年度の研究経費を用いて新規の倒立顕微鏡を購入するとともに、新規の顕微鏡に設置するマニピュレーター設置の改修作業を行っている途中であり、現時点までは順調に研究計画が進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はパッチ・クランプ実験装置の完成と、C2C12細胞を用いたパッチ・クランプ法による基礎実験を行う。研究代表者が有するパッチ・クランプ装置は老朽化が進んでいるため、パッチ・クランプアンプの改修、顕微鏡の新規購入をすでに行い、現在マニピュレーターシステムの改修をすすめてる。これの完成を待ち、ファラデーケージの作成、浴液灌流装置の設置、ノイズ低減など必要な作業を行い、本年度前半中にパッチ・クランプ装置を完成させる予定である。
本年度後半には、C2C12細胞を用いたパッチ・クランプ法のホールセル記録法により、La3+電流の記録を行う。C2C12細胞は、2%FCS含有培養液中で3日間分化させたものを実験当日にトリプシン処理によって単離し、35 mmディッシュに播種したものを用いる。パッチ・クランプ実験では、電極内液にの組成は2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 120 mM NaCl, 10 mM HEPES, 11 mM EGTA,4 mM Mg-ATPとし、細胞外液の組成は2 mM CaCl2, 135 mM NMDG-Cl, 10 mM HEPES, 10 mM glucoseとし、細胞外液に300 uMのLa3+の有無によるホールセル電流の変化を観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在パッチ・クランプ装置を作成中であるが、分子生物実験が予定よりも順調であったため、前倒し申請を行い今年度中に倒立顕微鏡の購入とマニピュレーター装置整備、灌流装置作成、ファラデーケージの作成を計画した。倒立顕微鏡の購入金額が予定よりも安価であったため、次年度使用額の一部が生じた。また、マニピュレーター装置整備、灌流装置およびファラデーケージ作成は現在進行中のため、これによって次年度使用額が生じている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額を用いて、マニピュレーター装置の整備と灌流装置作成等を行い、パッチ・クランプ装置を完成させる。具体的には本年度購入した顕微鏡に既存のマニピュレーターを取り付けるためのアタッチメント作成、マニピュレーターのオーバーホール作業、チャンバーおよび灌流装置ポンプの購入、ファラデーケージ用部材の購入等を行う。さらに、本年度行う基礎実験の薬品など消耗品の費用にもその一部を割り当てる。
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