| 研究課題/領域番号 |
15K01801
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
花島 慎弥 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 講師 (50373353)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 生体膜 / 脂質ラフト / スフィンゴ糖脂質 / コレステロール / NMR / DSC |
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| 研究実績の概要 |
糖脂質は、細胞膜に存在する機能ドメインである脂質ラフト分子複合体を形成して、タンパク質による認識を調節し、シグナル伝達を制御する重要な分子である。糖脂質が生理機能を発揮するときには、細胞膜内でラフト特異的な脂質と相互作用して、細胞表面にある糖脂質糖鎖の構造変化が誘起される事が示唆されている。しかしその実験的な根拠はきわめて乏しい。そこで、生体膜を模倣した環境に下において、NMRを用いることで、糖脂質の脂質ラフトにおける脂質間相互作用と続く構造変化を明らかにし、ラフト糖脂質分子集合体の全体構造の解明を目指し研究を進めた。
多様な糖鎖構造有するスフィンゴ糖脂質が知られているが、そのなかで二糖構造を有するラクトシルセラミドに着目した。ラクトシルセラミドは多くの糖脂質に共通する基本構造であるため、この糖脂質を解析することで、スフィンゴ糖脂質と他の脂質分子の相互作用の基本情報の取得を目指した。本年度は特にリン脂質を主成分とする生体模倣膜内でおこるラクトシルセラミドとコレステロールとの相互作用解析を固体2H NMRを用いておこなった。この測定を達成するために必須となる、アシル鎖の10位に重水素を組み込んだラクトシルセラミド標識体を合成した。合成したラクトシルセラミド標識体を不飽和リン脂質と混合し擬似的な脂質ラフト様環境を再現したリポソームを作成して、コレステロールとの相互作用を調べた。その結果、コレステロール非存在下では、リポソーム中でラクトシルセラミド同士が強く凝集したゲル相を形成し、NMRシグナルの広幅化をまねいた。一方、コレステロールが存在していると示される四極子分裂幅を観測し、コレステロールがラクトシルセラミド間の凝集をほぐし、コレステロールとラクトシルセラミドからなる秩序液体相を形成したことを示唆する結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、ラクトースとL-セリンを出発原料として、ラクトシルセラミドの重水素標識体の合成を達成した。今回確立した合成経路は、本研究で必要となるラクトシルセラミドの種々の標識パターンにも対応できる汎用性の高い経路になっている。さらに合成したラクトシルセラミド重水素標識体を用いて2H NMRシグナルを観測した。ラクトシルセラミドは70度以上の高温域にゲル－液晶の相転移温度を有するため、生体条件とかけはなれた高温域での測定になることが危惧されていたが、不飽和リン脂質を混合したリポソーム（MLV）を用いることにより、40度付近で測定してもNMRシグナルを観測することが可能あった。これは、コレステロールとラクトシルセラミドの相互作用を定量的に解析できたこととあわせて今後のNMR測定条件に関する重要な指針を得た。
さらに、脂質分子の相特異的な蛍光プローブであるBODIPY-PCを用い、ラクトシルセラミド含有リポソーム（GUV）の蛍光顕微鏡による相分離を観測した。その結果、2H NMRで用いたた各組成において、2H NMRで得られたラクトシルセラミド分子の運動性を裏打ちする相分離とドメイン形状が観測された。
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| 今後の研究の推進方策 |
脂質膜内でのコレステロールとラクトシルセラミドの相互作用に関して、再現性を確認する。またリポソーム作成に際して、二重膜にならずにミセル状になってしまっている成分が一部観察されているため、リポソーム（MLV）の作成手法に関して、更なる検討をおこなう。
脂質膜内でのコレステロールとラクトシルセラミドの相互作用の観測手法は確立されつつあるため、脂質膜上での糖鎖構造の変化に関して実験を進める。まずは、脂質膜内での相互作用がラクトシルセラミドの糖鎖構造に与える影響を定性的に調べる。具体的には、ラクトシルセラミドに結合する糖鎖結合タンパク質を用いて、ゲル相、秩序液体相、無秩序相と形成状態とその親和性を評価する。さらに、固体NMRを用いた糖鎖構造変化の解析法の検討をおこなう。
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