| 研究課題/領域番号 |
15K01815
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
中村 努 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (10357668)
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| 研究分担者 |
上垣 浩一 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, グループ長 (00356544)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | デアセチラーゼ / カドミウム錯体 / CE-14 family |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画ではN-アセチル基を加水分解する2種類の酵素DacおよびDAAをターゲットとしたものであるが、平成27年度はDacについて研究を進捗させた。Dacは単糖(GlcNAc)と二糖(GlcNAc2)の両方を基質とし、非還元末端のN-アセチル基を加水分解する酵素である。
まず、Dacの活性を215nmの吸光度で測定する系を確立し、基質飽和実験と阻害実験を行った。その結果、基質として単糖を用いた場合と二糖を用いた場合で、基質飽和曲線が変わらないということを明らかにした。このことにより、二糖が基質として反応するさいに、還元末端側の糖は酵素と特異的な相互作用をしていないことを示唆された。さらに、単糖アナログMPGによる阻害活性を測定した。その結果、MPGはDacと等モルで不可逆的に酵素阻害を起こすことが明らかになった。
Dacと単糖基質の相互作用はDac-MPG複合体の立体構造を結晶解析することにより明らかにした。Dacと二糖基質の相互作用は、Dac-GlcNAc2複合体の分子動力学計算により明らかにした。これらの結果、非還元末端の糖の水酸基が酵素のアミノ酸側鎖によって認識されている様子が高分解能で明らかになった。また、二糖基質の還元末端糖はDacの分子間クレフトにあり、基質飽和曲線からも示唆されるように、酵素との特異的な相互作用はないと結論づけられた。
以上とは別に、Dacの結晶内でのパッキングを解析した。その結果、P. furiosus Dacは、カドミウムの有無とセレノメチオニンの有無によりパッキングが変化することが明らかになった。特にカドミウムはN末端残基のセレンと錯体をつくり、その錯体が結晶内コンタクトに寄与していることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請書の「研究計画・方法」に記述した通りのことがおおむねできている。具体的には、Dac-MPG複合体の高分解能結晶構造解析と酵素学的データ収集ができたため、初年度はおおむね順調に進展したと判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に明らかにしたDac-MPG複合体の解析による基質認識の解明については、早急に論文発表を行わなければならない。
研究実施面では、D-アミノアシラーゼ(DAA)をターゲットとした実験に取り掛かる。T. roseum DAAの結晶はすでに得られており、形状も良いのであるが、なかなか中分解能以上の回折データが得られていない。そこで、他生物種からホモログを得て結晶解析することを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度には、(1) Dacの酵素学的測定 (2) Dacの構造解析 (3) 基質アナログのデザインと合成を計画していた。(1)と(2)に関しては望外に進捗し、試行錯誤が当初見積もっていたものよりも少なくて済んだ。そのために費用がおさえられた。また、それにともない構造計算の方向に研究を進展させ、(3)の遂行を後回しにしたため、(3)のための費用もおさえられた。以上の理由により次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度は、主にDAAの構造解析と機能解析（ホモログを含む）のために研究費を使用する。平成27年度にできなかった基質アナログのデザインと合成もこの年度に計画している。
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