| 研究課題/領域番号 |
15K01818
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
高橋 剛 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90345380)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | リガンド探索 / ペプチドライブラリ / 相互作用検出 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内におけるタンパク質の異常・機能破綻は、多くの疾患の発症を起こす原因となる。そのため、それらのタンパク質の挙動の解析や、機能制御は重要であり、それらのタンパク質に結合する合成リガンドの探索が精力的に行われている。当研究グループでは、化学合成したライブラリから、標的タンパク質に相互作用する分子を効率的に探索する手法として、リガンド－タンパク質の相互作用を酵素活性として読み出す新しい検出方法（IDNCL-PTS, IDNCL-ER）を開発してきている。この方法を用いて、がん関連タンパク質である、RasやSH2, Pin1などに結合する合成リガンドの探索を勧めている。
平成29年度は主に、IDNCL-ERに基づくルシフェラーゼ活性を指標とした新規検出系の開発と、それを用いた、Pin1結合ペプチドの探索を行った。NanoLucルシフェラーゼは、発光特性に優れている点や、安定性が非常に高いなど、レポーター酵素としての性質を備えている。そこで、NanoLucルシフェラーゼの分割体をもとに、相互作用に依存したネイティブケミカルライゲーションと酵素再構成（IDNCL-ER）を構築した。構築したシステムを用いて、既知のペプチド－タンパク質間の相互作用検出を行った。リン酸化ペプチドと、Src SH2タンパク質の相互作用検出では、NanoLucルシフェラーゼ活性を指標として、結合親和性を定量できることを明らかにした。次に、Pin1タンパク質に結合するペプチドの探索に必要となる6アミノ酸からなるポジショナルスキャニングライブラリを調製し、スクリーニングを実施した。その結果、固定した各残基における、Pin1との相互作用に寄与するアミノ酸に関する情報を得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度には、IDNCL-ERに基づくルシフェラーゼ活性を指標とした新規検出系の開発と、それを用いた、Pin1結合ペプチドの探索を行った。これまでに用いていた、ガラクトシダーゼを検出酵素とした相互作用検出システムと比較して、検出感度の大幅な向上が見られた。一方で、探索に用いたペプチドのポジショナルスキャニングライブラリの合成は、当初の予定よりも質の高いライブラリの作製が可能となった一方で、スクリーニングに必要な量のライブラリ合成に時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度までに、作製したペプチドライブラリを用いて、Pin1結合ペプチド配列を同定した。平成30年度は、同定したペプチド配列を個別に合成し、個々のペプチドとPin1との相互作用を定量する。得られた結果を基にさらに優れた結合能を示すペプチドを合成し、本手法の有用性を実証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該研究目標である、環状ペプチドライブラリの作製と、がん関連タンパク質に結合するペプチドリガンドの探索において、当初の予定よりも質の高いライブラリの作製が可能となった一方で、スクリーニングに十分な量のペプチドライブラリの作製に時間を要した。そのため、スクリーニングで得られたペプチドと標的タンパク質に対する結合能の評価や成果発表を次年度に行い、未使用額はその経費に充てることとしたい。
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