| 研究課題/領域番号 |
15K01820
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50557121)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | RNA高次構造 / 小分子化合物 / 翻訳–1フレームシフト / 翻訳制御 / バイオテクノロジー |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は，「小分子に誘起される－１リボソーマルフレームシフトにより，細胞内でタンパク質の輸送・局在を可逆的にコントロールする」ことである。本研究の目的を達成するために，平成27年度は以下の２つの項目に分けて研究を進めた。
1. NCT誘導体で翻訳－１フレームシフトを誘起する: NCT誘導体によるシュードノット形成の誘起が，翻訳－１フレームシフトを引き起こすかどうかをレポーターアッセイにより評価した。２種類のレポーター遺伝子（Fluc, Rluc）の間に，mouse mammary tumor virus (MMTV)のシュードノットをNCT誘起型に改変した配列を挿入したRNAを作製した。これを鋳型としてin vitro翻訳反応を行い，Fluc・Rlucの活性を測定した。その結果，翻訳－１フレームシフトが起こった時のみに合成されるFlucの活性が，NCT誘導体の存在下で確認された。これは，NCT誘導体がmRNA上にシュードノット構造を誘起し，フレームシフトを引き起こした可能性を示唆している。４種類のNCT誘導体（NCT5, 6, 7, 8）の中では，NCT8が最も効果的に翻訳－１フレームシフトを誘起することが分かった。
2) 翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列・リガンド構造を探索する: NCT誘導体によるフレームシフト効率の最大化を目指し，RNA配列の検討を行った。Infectious bronchitis virus (IBV)のmRNA上に存在するシュードノットは，高効率で翻訳－１フレームシフトを起こすことが知られている。そこでIBVのシュードノットをNCT誘起型に配列改変し，NCT誘導体による翻訳－１フレームシフト誘起が可能かどうか確認した。しかし，ゲルシフトアッセイ，レポーターアッセイともにNCT誘導体による翻訳－１フレームシフト誘起は確認されなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. NCT誘導体で翻訳－１フレームシフトを誘起する: おおむね順調に進展している。当初の予想通り，NCT誘導体によるシュードノット形成の誘起が，翻訳－１フレームシフトを引き起こすことが，レポーターアッセイにより確認された。同様の現象は，ウエスタンブロッティングによっても確認されており，NCT誘導体の濃度依存的に翻訳－１フレームシフト効率が上昇することも確認されている。
2) 翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列・リガンド構造を探索する: やや遅れいている。NCT誘導体によるフレームシフト効率の最大化を目指し，RNA配列の検討を行った。これまでに用いていたMMTVのシュードノットに加え，IBVのシュードノットをNCT誘起型に改変した配列を用いてゲルシフトアッセイ，レポーターアッセイを行った。しかし，NCT誘導体による翻訳－１フレームシフト誘起は確認されなかった。最適なRNA配列を見出すために配列のさらなる検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に得られた研究成果をもとに，NCT誘導体による翻訳－１フレームシフトの誘起が細胞内でも同様に起こるかを検証するとともに，標的タンパク質へのシグナルペプチドの付加に応用する。これらは，現在までに最も良好な結果が得られている，NCT誘起型MMTVシュードノットを用いて行う予定であるが，これと並行して，NCT誘起型IBVシュードノット配列の最適化を行い，翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列の取得を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究を進めるにあたり必要に応じて研究費を執行したが，いくつかの研究項目について若干の計画の変更があった。そのため，当該年度に行うことを予定していた研究内容を一部変更し，次年度に行うこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
変更した研究内容については次年度に実施予定であり，研究の全体計画に大きな変更はない。前年度の研究費も含め，当初予定していた研究計画に沿って研究を進める。
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