| 研究課題/領域番号 |
15K01827
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| 研究機関 | 長浜バイオ大学 |
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研究代表者 |
河合 靖 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (20240830)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 蛍光プローブ / がん細胞 / 分子イメージング / 酵素活性検出 / プテリン |
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| 研究実績の概要 |
プテリンを蛍光部位に導入した新規蛍光プローブを設計し、がん細胞で特異的に発現している酵素によってのみ発光するプローブを開発し、それらの細胞内での機能評価を行うことを目的としている。
平成28年度はすでに設計・合成した、酵素活性を蛍光のoff/onで検出できる種々のプローブを用いて、多くのがん細胞中で特異的に発現している酵素に適応可能かどうかを評価した。蛍光による酵素活性の検出は、本研究経費により平成28年度に設備備品として導入した蛍光プレートリーダーを用いて測定した。合成した数十種類の蛍光プローブに関して、種々の酵素を用いて検討したところ、グルタチオンSトランスフェラーゼ、カテプシン、カスパーゼおよびロイシンアミノペプチダーゼに関して、蛍光のoff/onによる酵素活性の検出が可能であることを確認した。特にグルタチオンSトランスフェラーゼ検出プローブに関しては20種類以上の化合物を合成し検討し、何れも酵素活性の検出が可能であることを確認した。
また、蛍光のoff/onによる酵素活性の検出に関する評価と並行して、光照射によるDNAへの酸化的ダメージの評価もin vitroで行った。DNAのモデル化合物としては、GGGGおよびAAAAテトラオリゴマーを用いて、蛍光がoffとon状態のそれぞれのプローブの存在下で360 nmの紫外線を照射して検討した。DNAの酸化的ダメージの有無はHPLCを用いて分析した結果、蛍光がon状態のプローブ存在下で、配列がGGGGのDNAオリゴマーの時のみ紫外線照射によるDNAの損傷が確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
密度汎関数を用いた量子化学計算により、酵素活性が蛍光のoff/onで検出できるように論理的に設計された新規蛍光プローブを数十種類合成した。これらのプローブの蛍光測定を行い、計画通り合成された化合物群がoff/on型蛍光プローブとして利用できることを確認した。さらにこれらのプローブを用いてin vitroでの酵素による実験を行い、がん細胞で特異的に発現している酵素の活性が検出可能であることを確認した。これらのことより特定の酵素活性によって蛍光のoff/onがスイッチングできる新規な蛍光プローブの開発に成功した。
また、これと同時に数種のDNAのオリゴマーに対してin vitroで蛍光プローブの存在下で360 nmの紫外線を照射し、DNAの酸化的損傷を評価した。その結果、蛍光がon状態のプローブの時にだけ、グアニンが連続する配列のDNAに対してのみDNAが損傷を受けていることを確認した。これによりプローブの蛍光がon状態の時のみ紫外線照射によって配列特異的にDNAに酸化的ダメージを与えられることが示された。
以上の事から、概ね当該年度の目標は達成できていると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度も当初の計画通りに進める。まずはin vitroで酵素活性によるoffからonへの蛍光スイッチングと紫外線照射による配列特異的DNAオリゴマーの損傷評価をする。そして最終的には蛍光プローブのがん細胞選択的な取り込み、酵素活性によるoffからonへの蛍光スイッチング、及び光照射によるDNA損傷の三つの機能を最終的に細胞系で評価する。各種細胞を培養し、前年度に開発された蛍光プローブを導入して共焦点レーザー顕微鏡で観察し、がん細胞可視化プローブとしての性能を評価する。期待通りの性能を有するプローブに関して、光照射によるDNAダメージとそれによる細胞増殖抑制の効果を評価する。もし計画通りに蛍光プローブが機能していない場合には、これら細胞内での評価を設計段階にフィードバックして、更に効率の良いプローブを設計・合成するという段階を繰り返す事で改良を重ね、最終的に効率的な多機能化学療法剤を開発する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の計画段階では、新規化合物である蛍光プローブが実際の酵素活性を検出できるかどうか、数多くの由来の酵素を用いるなどの試行錯誤が予想された。そのために酵素関連試薬の購入を多く予定していたが、実際には効率的に活性測定に成功する事ができ、予定より少ない予算で研究計画が達成できたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
繰り越した助成金は、合成したプローブを用いて詳細なDNA損傷効果を評価するために、より多くのDNAオリゴマーを購入して研究を実施するために使用する予定である。
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