| 研究課題/領域番号 |
15K05393
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
中島 聡 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (80263234)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | チトクローム酸化酵素 / プロトンポンプ / 振動分光法 / 時間分解 / 共役機構 / 逐次的反応 |
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| 研究実績の概要 |
チトクロムc酸化酵素は酸素の還元反応と共役したプロトンの能動輸送を行う。この中で酸素の還元反応とプロトンポンプ共役機構に関して、いまだ詳細は明らかになっておらずその解明が最重要課題である。この共役機構を解明するために時間分解の共鳴ラマン分光法と赤外吸収分光法という振動分光法による酸素還元反応の追跡を行った。まず、ラマン分光法では酸素のモデルとしてCOを用い、その光解離過程を追跡することで還元反応サイトの配位子脱着に伴う蛋白質のダイナミクスを調べた。その結果、プロトンポンプ経路に直結したヘリックスにヘムa3が配位した残基がまず緩和し、続いてヘムa3の位置がシフトすることが起こる。また、このシフトはプロトンポンプ経路の水素結合状態によって影響され、プロトンが少ない（生理反応中では反応の後期課程）では、シフトは小さくかつ遅く起こることがわかった。構造解析の結果からはこうしたヘムa3のシフトがプロトンポンプを引きおこすことが示唆されており、実際にそうした現象が反応中でも起こっていることが示された。またさらに遅れてプロトンポンプ経路横のヘムaが動くことも見いだされた。これらの段階的緩和は初めて観測されたもので、プロトンポンプ共役機構モデルを説明する上で重要な結果となった。また赤外分光法では、酸素還元反応を観測できるようなフローセルシステムが完成し、それを用いた時間分解測定を行った。プロトン化したサイトを観察できる領域を測定することに初めて成功した。こうした反応過程を実時間の赤外吸収での測定が可能になった最初の例である。この中でプロトン放出サイトのバンドが時間発展にともない、強度変調と波数シフトすることが見いだされた。酸素還元反応中ではいくつかの中間体を経ることがわかっており、これらの状態でプロトンが放出されかつその中間体に合わせた水素結合状態をとることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画では、時間分解の時間分解の共鳴ラマン分光法と赤外吸収分光法という振動分光法による酸素還元反応の追跡を行うための新たなシステムを立ち上げてその測定を行うことを想定していた。特に赤外分光測定においては、酸素還元反応の測定を実時間で行うため、ナノ秒からミリ秒にいたる時間領域を測定できるシステムの構築が必要であった。赤外吸収の特性において溶媒である緩衝溶液の吸収が極めて強く、それらを避けて極めて微小な信号変化を捉える必要があり、極めて光路長の薄い（50μm）を、精度良くフローさせるセルを作成する必要があった。また、微弱な信号（0.02%以下）を観測するために積算を重ねる必要があり、すべての観測システムを同期させて繰り返しをおこなうような測定系を構築する必要があった。さらに空気中の水蒸気の吸収が信号の何十万倍存在するために、完全に密閉して水蒸気を取り除いた環境で測定を行う必要があった。多くの試行錯誤をへて、これらの課題をすべてクリアーして、実時間の赤外吸収測定に成功したので、順調に計画が進行しているといえる。
次に、ラマン分光法の測定においては既存のシステムを用いたが、試料の条件を様々に変更することを可能にして、その測定を行った。また、測定条件を詳細に検討することで、想定よりも充分高い精度での測定が可能になった。このことは得られた結果の解析に大きな威力を発揮し、蛋白質ダイナミクスの詳細を議論することを可能にした。この点は良い意味で想定外であり、この酵素機能の全体像に迫ることができる可能性を示した。今後はこの方法をより広い範囲に適応する着想を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず成果・進捗状況でも述べたように（１）時間分解赤外分光測定に成功したこと（２）時間分解ラマン分光測定で新たな適応が示唆されたこと、があるので、今後はこれらを発展させて行きたい。
（１）に関してはこれだけでも当初計画からすれば充分な成果であるが、より適応範囲を広げて行きたいと考えている。具体的には、脱プロトン化した領域はより水溶液の干渉が強い領域であるので、より薄い光路長（25μm）を持ったセルを設計して、この領域の観測を試みる。現在予備実験が進行しており、測定の可能性が見えてきている段階である。これが完成すれば、プロトン化・脱プロトン化が実時間で観測可能なため、まさにプロトンポンプそのものが直接的に観測できる。このことは、当初計画のチトクローム酸化酵素のプロトンポンプ共役機構の解明につながることはもちろんのこと、水溶液中に存在する一般的な蛋白質反応全般に対して、アミノ酸１残基ごとにプロトン化状態が観測できる手法を確立することに成功することにつながる。これは当初計画よりさらに進んだ成果になる可能性があり、協力に推進したい。またさらに薄いセル（<15μm）にもチャレンジしたい。これには従来法に加えて新たな手法が必要となることが想定されるが、これが可能になれば蛋白質の主鎖構造のダイナミクスの追跡が可能になるため、大きく発展することが考えられる。
（２）についは、MV状態を光励起することで電子移動反応を起こることが知られており、反応中の電子移動に伴う蛋白質ダイナミクスの追求を目指す。この酵素は還元反応・電子移動・プロトンポンプと３つ基本的な化学反応が極めて巧みに共役して起こっているので、こうした共役がどのようにして起こるか要素に分解して観察することは単に酵素機能の解明につながるだけでなく、より一般的な化学反応過程の制御機構への示唆を与えることが期待できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度使用を予定していた消耗品で、特に赤外分光測定関係の物のうち、ガラス製品・ポリマー製部品などに関して、想定よりも技術的な使用方法が向上したため、消耗せずに活用することができた。実験としては進みデータの蓄積も行えたが、さらに（予算が必要となる）応用範囲を広げるシステムの構築には至らなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現有のシステムでデータの蓄積が進んできたので、より適応範囲を広げることの可能なシステムを当初計画に加えて構築することを目指す。具体的にはより光路長の短いCaF2フローセルシステムを開拓し、蛋白質の脱プロトン化状態の測定や、蛋白質骨格振動(Amid I band)などの観測を目指す。
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