| 研究課題/領域番号 |
15K05529
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
寺井 琢也 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (00508145)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 分子認識 / 合成化学 / 共焦点顕微鏡 / 蛍光センサー |
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| 研究実績の概要 |
本年度は主に細胞膜上でカリウムイオンを検出可能なタグタンパク質ラベル化型蛍光プローブの開発と応用を行った。具体的には、研究代表者が以前開発したHaloTagラベル化型デキストラン修飾カリウム蛍光プローブの問題点であった蛍光量子収率の低さを、水溶性部位として（デキストランに替えて）スルホ基含有ペプチドを導入することによって改善した。これによって、カリウムイオンに選択的に応答して蛍光強度が10倍以上に上昇し、かつHaloTagタンパク質と速やかに共有結合を形成する、実用的な可視光励起蛍光プローブを作ることができた。更に、共焦点顕微鏡を用いたイメージングにおいてS/Nを低下させる原因であった「焦点面のずれ」「細胞の変形・移動」等に起因する蛍光シグナルの変動を、内部標準蛍光リガンドの併用によって大幅に改善することに成功した。これらの改善により、一細胞レベルでの蛍光イメージングにおいても十分な感度でカリウム濃度変化を検出することが可能になった。
上記の結果を踏まえ、細胞表面に足場となるHaloTagタンパク質およびBKカリウムイオンチャネルを発現させたHEK細胞に対して開発したプローブをロードし、パッチクランプ法により脱分極刺激を与えたところ、細胞内からBKチャネルを介して放出されてくるカリウムイオンの動態を捉えることに成功した。細胞表面でのカリウムイオン濃度変化を選択的にイメージングした例は研究代表者の知る限り他になく、本研究で開発した方法論はカリウムイオンの生理機能解明に有用と期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の計画通り、先行研究における課題を克服した新規カリウムイオン蛍光プローブの開発および定量的イメージング手法の確立に成功したのみならず、当初の計画では平成28年度の検討項目であった、刺激に応じて細胞膜上のイオンチャネルから放出されるカリウムイオンの時空間的イメージングについても達成することができた。また、一過性の強制発現だけでなく内在性のBKチャネルから放出されるカリウムイオンについてもイメージングに成功しており、期待以上の成果が得られたといえる。また、本成果を分析化学分野の一流紙に発表することもできた。
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| 今後の研究の推進方策 |
カリウムイオン蛍光プローブについては、生物系研究者との共同研究等によって更なる応用例を積み重ねると共に、必要に応じてプローブの改良を行いたいと考えている。これと並行して、次年度以降はナトリウムを中心とする新たな分子種に対する蛍光プローブの開発を行う計画である。最近注目されているナトリウムイオンの細胞内動態を解明するためには、カリウムとは異なり細胞内の特定の小器官に対して選択的にプローブを送達する必要があるが、これまでに得られた知見・経験を基にすることで目標の達成が見込まれる。
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