| 研究課題/領域番号 |
15K05550
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| 研究機関 | 明星大学 |
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研究代表者 |
田代 充 明星大学, 理工学部, 教授 (40315750)
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| 研究分担者 |
吉村 悦郎 東京大学, 農学生命科学研究科, 教授 (10130303)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 分子間相互作用 / タンパク質 / リガンド / フッ素化合物 / 核磁気共鳴 / 選択的検出 |
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| 研究実績の概要 |
本申請課題では、標的タンパク質と結合する含フッ素化合物（リガンド）の検出において、水素原子と共にフッ素原子もマーカーとして、高感度および選択的に検出できる核磁気共鳴法の開発を目指している。① 軽水溶液(95% H2O+5% D2O)として測定可能であり、② 親和性のあるリガンドの高精度選択的検出に加え、③ 分子間相互作用に関与するリガンド中の原子団を、フッ素原子に着目して特異的に検出し、原子レベルで解析できる手法の開発を目的とし、研究を遂行している。
NMRスペクトル測定のため、アジレントテクノロジーよりH/F/Xプローブを借用し、2種類の異なる高周波核を対象にした測定を行っている。複合体の調製では、レセプターおよびリガンド共に市販品を使用し、モデルシステムとして、ヒト血清アルブミン－ジフルニサルおよびヒト血清アルブミン－エノキサシンを使用した。両リガンド共に水への溶解度が低いため、pHを調製し、安定な溶存状態の検討を行った。ジフル二サルなどの含フッ素化合物をリガンドとして用いる場合、高周波核であるフッ素による特異的検出が、感度の点から有効な解析法になるものと考えられる。最初に水またはタンパク質の1Hを選択励起し、その磁化をリガンド中の19Fに移動させて検出する。タンパク質の1Hを選択励起し、飽和させた後に結合するリガンドに磁化移動させる飽和移動差スペクトル（STD）法を試したところ、比較的感度良くフッ素シグナルを検出できた。今後、選択励起方法および磁化移動の方法に焦点をあてて、パルスシーケンスの検討を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
タンパク質の1Hを選択励起し、飽和させた後に磁化を結合するリガンドに移動させ、フッ素核で検出する飽和移動差スペクトル（STD）法を試したところ、比較的感度良くフッ素シグナルを検出できた。1Hを選択励起する際、どの周波数に設定するかで、検出感度に影響を与えることは予想されたものの、1H検出と比較すると低感度である結果が得られた。タンパク質の1H密度の高いシグナルを選択照射することが高感度化につながるが、リガンド自身を照射できないため、照射位置に制約がある。このため、照射位置を数点変えながら感度の比較を行った。
実際の測定では、リガンド分子のみの重水溶液を調製し、メチル基領域を選択照射した。タンパク質が存在しないため、当然、磁化移動は起こらず、シグナルは検出されなかった。同様の測定を軽水溶液(95% H2O+5% D2O)でも行い、水を選択照射し、リガンドの19Fシグナルの位相調整を行った。次に、タンパク質を添加した試料溶液で、水を選択照射し、位相を変えずに19F検出を行ったところ、逆位相のシグナルが観測され、タンパク質と結合するリガンドの19Fシグナルが選択的に検出できることが明確になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 1H-19F WaterLOGSY法への応用および選択励起方法の検討
タンパク質の1Hを選択励起し、飽和させた後に磁化を結合するリガンドに移動させる飽和移動差スペクトル（STD）法では、良好な結果が得られた。次の段階として、WaterLOGSY法を19F検出に応用した測定法を検討する。WaterLOGSY法はSTD法と共に、製薬会社などで広く使用されている方法であり、申請者らも、パルスシーケンスの開発を行ってきた。通常のSTD法では、良好な結果が得られており、次のステップとして、H2O:1H励起→19F検出をWaterLOGSY法に取り入れる。
(2) エレクトロスプレーイオン化質量分析法による複合体形成の確認
NMR測定と平行して、エレクトロスプレーイオン化質量分析法により、複合体形成の確認を行う。少量の試料で複合体形成の確認が可能であるため、種々の溶液条件での最適化および他のモデルシステムでの検討を行う。
(3) 1H－縦緩和時間による結合部位の検討
レセプターであるタンパク質の1H選択照射および非照射の条件で1H－縦緩和時間(T1)の測定を行う。縦緩和時間の逆数が緩和速度に相当し、照射‐非照射における緩和速度の差をリガンドの各1Hについて求める。結合に直接関与する1Hでは、緩和速度の差が相対的に大きくなることが予想され、リガンドの結合部位に関する情報が得られるものと期待できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
化学試薬類の使用が予想より下回り、高額な試薬の購入がなかったため。また、核磁気共鳴装置の修理費が予想より下回ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度、液体ヘリウムの充填費用（255,000円ｘ2回）を支出する予定であり、核磁気共鳴装置の液体窒素再凝縮装置のメンテナンス修理を行う予定である。
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