| 研究課題/領域番号 |
15K05556
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
奥野 貴士 山形大学, 理学部, 准教授 (80411031)
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| 研究分担者 |
櫻井 敏彦 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (10332868)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 膜タンパク質 / 高感度計測 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト細胞膜の細胞質側で繰り広げられる生体反応の定量的評価は容易ではない。本研究は、ヒト培養細胞から調製した細胞膜試料を微細加工基板上に固定し、細胞膜を介した物質や情報伝達を簡便かつ高感度に計測する方法を創生し、新たな膜タンパク質の物性や機能解明に挑戦している。昨年度までに、微細加工基板表面への固定条件検討および、マニピュレーション方法を検討し、微細加工基板上への細胞膜試料（Giant plasma membrane vesicles :GPMVs）を固定する方法を検討した。本年度は主として、微細孔上への成膜方法の検討と基板に固定した細胞膜の標的タンパク質の評価を実施した。
微細孔上に固定したGPMVsの膜を展開することで、微細孔を覆うように細胞膜を固定する方法を検討した。昨年度までに確立した微細孔へのマニピュレーション効率は９０％程度まで効率を上げることができており、それを使い成膜条件を検討した。その結果、超音波処理と水流より、微細孔上に膜を展開できることを確認した。今回、超音波の周波数や強度など様々な照射条件を検討したが、成膜化の再現性が低く、今後出力計測しながら、条件検討を実施する予定である。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、作製した微細加工基板内に蓄積する蛍光色素をイメージングできることが確認でき、膜を介した物質輸送評価系の構築に大きな手がかりを得ることができた。
一方、標的タンパク質についてもいくつか準備が出来てきた。現在、Transferrin receptor (TFR)、Cadherin、Integrin等の膜タンパク質にGFPを融合したタンパク質を発現した培養細胞から調製したGPMVsを作製し、基板上に固定し、それら膜タンパク質のトポロージーが維持されていることを確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト細胞膜の細胞質側で繰り広げられる生体反応の定量的評価は容易ではない。本研究は、ヒト培養細胞から調製した細胞膜試料を微細加工基板上に固定し、細胞膜を介した物質や情報伝達を簡便かつ高感度に計測する方法を創生し、新たな膜タンパク質の物性や機能解明に挑戦している。昨年度までに、微細加工基板表面への固定条件検討および、マニピュレーション方法を検討し、微細加工基板上への細胞膜試料（Giant plasma membrane vesicles :GPMVs）を固定する方法を検討した。本年度は主として、微細孔上への成膜方法の検討と基板に固定した細胞膜の標的タンパク質の評価を実施した。
微細孔上に固定したGPMVsの膜を展開することで、微細孔を覆うように細胞膜を固定する方法を検討した。昨年度までに確立した微細孔へのマニピュレーション効率は９０％程度まで効率を上げることができており、それを使い成膜条件を検討した。その結果、超音波処理と水流より、微細孔上に膜を展開できることを確認した。今回、超音波の周波数や強度など様々な照射条件を検討したが、成膜化の再現性が低く、今後出力計測しながら、条件検討を実施する予定である。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、作製した微細加工基板内に蓄積する蛍光色素をイメージングできることが確認でき、膜を介した物質輸送評価系の構築に大きな手がかりを得ることができた。
一方、標的タンパク質についてもいくつか準備が出来てきた。現在、Transferrin receptor (TFR)、Cadherin、Integrin等の膜タンパク質にGFPを融合したタンパク質を発現した培養細胞から調製したGPMVsを作製し、基板上に固定し、それら膜タンパク質のトポロージーが維持されていることを確認できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
H29年度では、微細加工基板上に固定した細胞膜を介した物質輸送および情報伝達の計測を実施する予定である。H28年度までに微細孔への成膜化に成功している。未だ成膜効率が低いため、データ収集に多くの時間を費やすことが予測される。そこで、成膜効率の向上と計測を並行しての実施を計画している。主として、研究代表（奥野）と修士学生（１名）と学部４年生（１名）での実施を予定している。研究担当はそれぞれ、基板作製と基板表面修飾：奥野、成膜効率の向上：修士学生、計測方法の確立：４年生の実施体制を敷くものとする。昨年度の実施状況から、微細孔への成膜効率が研究進度のボトルネックとなっている。そこで、研究目標を達成するために、いくつかの問題解決方法を準備している。成膜効率が低い理由として、細胞膜と基板の接触面積が小さく、超音波処理時に壊れたり基板から外れたりしている。そこで、培養細胞から調製するGPMVsの平均サイズを大きくする方法をいくつか検討する。また、現在、培養細胞としてHeLa細胞を用いているが、細胞の種類を変えるなどして、GPMVsサイズアップを検討する。また現在、細胞膜と基板表面は、主として静電的相互作用により固定している。そこでより強固に細胞膜を基板に固定するために、共有結合を介した基板と細胞膜の固定方法などについての検討を計画していく。一方、物質輸送の計測する標的タンパク質としてP糖タンパク質を用いる。すでに、Caco2細胞からのGPMVsの作製方法を確立している。本年度においては、P糖タンパク質を発現するCaco2細胞膜の固定を優先的に実施し、基質となる蛍光分子の輸送計測を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度、計画予定になかった研究室の移設工事が７－８月にかけて生じ、その期間の研究が一時的に停止し、その間の消耗品等の使用が無い期間が生じたため、当初の予算よりも若干使用額が少なくなったため。具体的には、実施計画していた蛍光色素および抗体を用いた実験が、若干少なくなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は、昨年度購入していなかった蛍光色素および抗体等を購入するため、H29年度の使用にあたり無理の生じない予算となる。
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