| 研究実績の概要 |
前年度までに部位特異的変異解析と速度論解析によりコリン型リゾプラズマローゲン特異的ホスホリパーゼD(LyPlsCho-PLD)が基質ヘッドグループとsn-1位アルケニルエーテル鎖を識別している可能性が高いと結論付けた。最終年度では酵素の基質結合部位および活性中心部位を構成するアミノ酸のうち、基質認識に関与するアミノ酸残基を解明し、基質認識メカニズムの全貌解明を目指して、より詳細な部位特異的変異解析と速度論解析を行った。さらに、所望の基質特異性を持つ酵素への改良を試みた。
W282A, R変異体は、いずれもWild typeの基質特異性とは大きく異なり、本来の基質LyPlsChoに対する活性が完全に消失し、アルキルエーテルリン脂質Lyso-PAFに対する活性はわずかに残存していた。一方、W282M, G変異体の基質特異性はWTと同様であったが、両基質に対する活性が著しく低下した。W282G変異体の速度論解析により、W282は基質との結合よりもむしろ反応生成物の遊離に関係することがわかった。N173A, I, Q変異体とF211変異体は、いずれも基質特異性が逆転する(Lyso-PAF > LyPlsCho)という興味深い結果が得られた。さらに、F211変異体についてはLyPlsChoに対する活性が大幅に低下し、小さな側鎖をもつアミノ酸（AlaやLeu等）への置換によってLyso-PAFに対する活性が著しく増加した。F211変異体の速度論解析により、F211は基質結合段階よりむしろ生成物遊離過程（k+2）への関与が大きいことを示唆する結果が得られた。また、F211が基質分子中のsn-1位アルケニル/アルキルエーテル鎖の認識に関与していると結論づけた。
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