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2015 年度 実施状況報告書

血中microRNA追跡型遺伝子制御素子の開発

研究課題

研究課題/領域番号 15K05564
研究機関京都大学

研究代表者

山吉 麻子  京都大学, 白眉センター, 准教授 (70380532)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワードmicroRNA / exosome / DDS / 抗体 / 核酸
研究実績の概要

近年、T 細胞、血小板、上皮細胞、免疫細胞や癌細胞をはじめとする多様な細胞がexosome(エキソソーム)と呼ばれる直径40-100nmの小胞を放出することにより、遠く離れた細胞まで情報を伝達する機構が見出された。とりわけ、血中に分泌されたエキソソームに含まれるmicroRNAが、ガン細胞の増殖能ならびに転移能を支配するという新たなメカニズムが示唆されており、非常に注目を浴びている。我々は、血中microRNAを標的とした新規DDS開発を目指している。血中エキソソームは体内を循環し、他の細胞に取り込まれた後、内包しているmicroRNAを放出する。エキソソームはCD63、CD9などの表面抗原を持つが、これら表面抗原を認識する抗体をコンジュゲートした核酸を開発する。このコンジュゲートを血中投与しエキソソームに付着させ、エキソソームが細胞内に導入されるに随伴してコンジュゲートも取り込まれ、エキソソーム内のmicroRNAの機能をantimiRによって阻害しようという戦略である。この様なコンセプトに基づいてエキソソーム内のmicroRNAの機能を阻害しようという手法が未だ報告されていないことから、エキソソームの表面抗原を認識する抗体をコンジュゲートした核酸(Cy5標識)を合成し、細胞培養上清に添加した後、結合したエキソソームに付随して標的細胞に送達されるか評価した。共焦点レーザー顕微鏡による観察の結果、[anti-CD63抗体:核酸]コンジュゲートの場合には細胞質にCy5の蛍光が観察されたが、コントロール分子([anti-BSA抗体:核酸]コンジュゲート)の場合には細胞内に蛍光が観察されなかった。この結果より、エキソソームに結合したコンジュゲートが細胞内に取り込まれたことが示された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究のコンセプトに基づいてエキソソーム内のmicroRNAの機能を阻害しようという手法が未だ報告されていないことから、本年度はエキソソーム表面抗原を認識する抗体(anti-CD63抗体)の細胞内侵入能、、[anti-CD63抗体:核酸]コンジュゲートの細胞内侵入能ならびに細胞内局在を評価するところからスタートした。蛍光標識した抗体ならびにコンジュゲートは標的の細胞内に導入され、共焦点レーザー顕微鏡によって細胞内局在を詳細に解析することにも成功した。このステップで1番時間を要すると思われたが、予想以上に順調に研究が遂行し、特許出願も達成出来た(特顔2016-28924)。このため、自己評価を区分(1)と判断した。

今後の研究の推進方策

ガン細胞亢進性 microRNA に対する [anti-CD63抗体:核酸]コンジュゲートの効果を検証する。対象の1つとして、日本人の死因第1位であり、microRNA量との関連を示唆する論文が多く報告されている『ガン』を選択する。右記の表に示した様に、既に様々な進行ステージにおいて、様々なガン組織中にmicroRNAが検出されており、進行ステージのみならず初期ステージにおいても健常者と比較して有意にmicroRNA量が増加することが報告されている。この他にも、既に医学論文に掲載された既知なガン関連microRNA(PNAS, 2008 July 29, vol.105, 10513-8; PNAS, 2005 March 8, vol.102, 3627-32; Oncol Rep. 2014 May 31, 2293-7; Mol Med Rep. 2014 Apr 4; PLoS One. 2014 Apr 16, e95240; PLoS One. 2014 Mar 17, e92099; Expert Rev Anticancer Ther. 2014 Apr 14, 463-85; Biochem Biophys Res Commun. 2014 Feb 7, 199-204; Br J Cancer. 2014 Feb 18, 1001-7)を標的としたRINDA-Oligoならびに [anti-CD63抗体:核酸]コンジュゲートを合成し、ガン細胞増殖抑制能、遊走能、浸潤能などを評価する。

  • 研究成果

    (23件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (17件) (うち国際学会 7件) 図書 (1件) 産業財産権 (3件) (うち外国 1件)

  • [雑誌論文] Cross-Linking Antisense Oligodeoxyribonucleotides with a Photoresponsive α-Chloroaldehyde Moiety for RNA Point Mutations2016

    • 著者名/発表者名
      Sugihara Y., Nakata Y., Yamayoshi A., Murakami A., Kobori A.
    • 雑誌名

      J Org Chem

      巻: 81 ページ: 981, 986

    • DOI

      doi: 10.1021/acs.joc.5b02573

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Development of Novel Antisense Oligonucleotides for the Functional Regulation2015

    • 著者名/発表者名
      Ariyoshi, J., Momokawa, D., Eimori, N., Kobori, A., Murakami A., Yamayoshi, A.
    • 雑誌名

      Bioconjugate Chemistry

      巻: 26 ページ: 2454, 2460

    • DOI

      doi: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00501.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] RISC機能の制御を目指した遺伝子発現制御素子の開発(Ⅳ)アンチセンス核酸の化学構造がRISCからのmicroRNA解離効果に与える影響2016

    • 著者名/発表者名
      有吉 純平、栄森 奈緒、小西 諒、小堀 哲生、村上 章、山吉 麻子
    • 学会等名
      日本化学会第96春季年会
    • 発表場所
      同志社大学 京田辺キャンパス
    • 年月日
      2016-03-24 – 2016-03-27
  • [学会発表] Development of a novel system for evaluation of binding affinities between RISC and antisense oligonucleotides2016

    • 著者名/発表者名
      Konishi Ryo, Ariyoshi Jumpei, Matsuyama Yohei, Nakamura Hiromi, Akio Kobori, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      日本化学会第96春季年会
    • 発表場所
      同志社大学 京田辺キャンパス
    • 年月日
      2016-03-24 – 2016-03-27
  • [学会発表] Development of a novel drug delivery system for targeting microRNA2016

    • 著者名/発表者名
      Kishimoto Yusuke, Rie Tamura, Chie Muramatsu, Akio Kobori, Eishi Ashihara, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      日本化学会第96春季年会
    • 発表場所
      同志社大学 京田辺キャンパス
    • 年月日
      2016-03-24 – 2016-03-27
  • [学会発表] Novel inhibitors targeting microRNA: Peptide-oligonucleotide conjugates for promotional releasing of microRNA from RISC2015

    • 著者名/発表者名
      Ariyoshi Jumpei, Eimori Nao, Konishi Ryo, Akio Kobori, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      THE INTERNATIONAL CHEMICAL CONGRESS OF ACIFIC BASIN SOCIETIES 2015
    • 発表場所
      Hawaii Convention Center, U.S.A.
    • 年月日
      2015-12-15 – 2015-12-21
    • 国際学会
  • [学会発表] Development of novel anti-HIV drugs that mimic functions of non-coding RNA2015

    • 著者名/発表者名
      Asako Yamayoshi, Kodai Yoshimoto, Akio Kobori, Akira Murakami
    • 学会等名
      THE INTERNATIONAL CHEMICAL CONGRESS OF ACIFIC BASIN SOCIETIES 2015
    • 発表場所
      Hawaii Convention Center, U.S.A.
    • 年月日
      2015-12-15 – 2015-12-21
    • 国際学会
  • [学会発表] Development of novel functional oligonucleotides for regulation of RISC functions (II) The structural insight of ASO on release of miRNA from RISC2015

    • 著者名/発表者名
      Ariyoshi Jumpei, Konishi Ryo, Eimori Nao, Akio Kobori, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      第一回日本核酸医薬学会
    • 発表場所
      京都テルサ
    • 年月日
      2015-11-30 – 2015-12-01
  • [学会発表] Development of a novel RNAi therapeutic method for malignant tumor using cationized antibody2015

    • 著者名/発表者名
      Kishimoto Yusuke, Rie Tamura, Chie Muramatsu, Akio Kobori, Eishi Ashihara, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      第一回日本核酸医薬学会
    • 発表場所
      京都テルサ
    • 年月日
      2015-11-30 – 2015-12-01
  • [学会発表] Development of novel functional oligonucleotides for regulation of RISC function (III) Design of peptide-oligonucleotide conjugates for the release of microRNA from RISC2015

    • 著者名/発表者名
      Nao Eimori, Ariyoshi Jumpei, Akio Kobori, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      第一回日本核酸医薬学会
    • 発表場所
      京都テルサ
    • 年月日
      2015-11-30 – 2015-12-01
  • [学会発表] Development of transcriptional inhibitor with a specific binding affinity to HEXIM12015

    • 著者名/発表者名
      Kodai Yoshimoto, Kyosuke Kishimoto, Akio Kobori, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      第一回日本核酸医薬学会
    • 発表場所
      京都テルサ
    • 年月日
      2015-11-30 – 2015-12-01
  • [学会発表] Development of novel RISC inhibitors for promoting release of microRNA from RISC (II) The effects of chemical modifications of oligonucleotides on releasing of microRNA from RISC2015

    • 著者名/発表者名
      Ariyoshi Jumpei, Eimori Nao, Konishi Ryo, Akio Kobori, Akira Murakami, Asako Yamayoshi
    • 学会等名
      The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
    • 発表場所
      Eagle Himeji, Hyogo, Japan
    • 年月日
      2015-09-23 – 2015-09-25
    • 国際学会
  • [学会発表] Hypoxia-Specific oligonucleotide Therapeutics System with Intracellular Environment-Responsive Peptide Ribonucleic Acids (PRNAs)2015

    • 著者名/発表者名
      Ryohei Uematsu, Hiroka Sugai, Mitsuo Asai, Masato Inagaki, Seiji Sakamoto, Satoru Ishibashi, Hiromi Kashida, Asako Yamayoshi, Yasuyuki Araki, Hiroyuki Asanuma, Takanori Yokota, Takehiko Wada
    • 学会等名
      The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
    • 発表場所
      Eagle Himeji, Hyogo, Japan
    • 年月日
      2015-09-23 – 2015-09-25
    • 国際学会
  • [学会発表] Translational inhibition of EGFP mRNA in HeLa cells using photoresponsive oligonucleotides with a caged α-haloaldehyde group2015

    • 著者名/発表者名
      Yuta Sugihara, Yuki Nakata, Asako Yamayoshi, Akira Murakami, Akio Kobori
    • 学会等名
      The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
    • 発表場所
      Eagle Himeji, Hyogo, Japan
    • 年月日
      2015-09-23 – 2015-09-25
    • 国際学会
  • [学会発表] Gene Silencing by Chemically Modified siRNAs Bearing Cationic Charge on 5’-End2015

    • 著者名/発表者名
      Yu Ohno, Kanami Akaike, Yasuhiro Shinkai, Hirohumi Fujii, Ayumi Takashina, Jumpei Ariyoshi, Asako Yamayoshi, Akira Murakami, Masayuki Fujii
    • 学会等名
      The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
    • 発表場所
      Eagle Himeji, Hyogo, Japan
    • 年月日
      2015-09-23 – 2015-09-25
    • 国際学会
  • [学会発表] Gene Silencing by miRNA-like siRNAs Bearing Mismatches and Bulges2015

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiro Shinkai, Hirohumi Fuji, Yu Ohno, Kanami Akaike, Ayumi Takashina, Jumpei Ariyoshi, Asako Yamayoshi, Akira Murakami, Masayuki Fujii
    • 学会等名
      The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
    • 発表場所
      Eagle Himeji, Hyogo, Japan
    • 年月日
      2015-09-23 – 2015-09-25
    • 国際学会
  • [学会発表] 人工核酸によるnon-codingRNAの機能制御(Ⅴ) microRNAを標的とした機能性核酸の設計指針2015

    • 著者名/発表者名
      有吉 純平、栄森 奈緒、小西 諒、小堀 哲生、村上 章、山吉 麻子
    • 学会等名
      第25回 バイオ・高分子シンポジウム
    • 発表場所
      東京工業大学 大岡山キャンパス
    • 年月日
      2015-07-23 – 2015-07-24
  • [学会発表] 核酸ドラッグの RISC に対する結合親和性評価法の開発2015

    • 著者名/発表者名
      小西諒、松山洋平、有吉純平、小堀哲生、村上章、山吉麻子
    • 学会等名
      生化学会第61会近畿支部例会
    • 発表場所
      立命館大学 びわこ草津キャンパス
    • 年月日
      2015-05-16 – 2015-05-16
  • [学会発表] RISC の microRNA保持機構を標的とした機能性核酸の開発2015

    • 著者名/発表者名
      山吉 麻子、有吉 純平、小堀 哲生、村上 章
    • 学会等名
      第15回遺伝子・デリバリーシンポジウム
    • 発表場所
      京都薬科大学 愛学ホール
    • 年月日
      2015-05-01 – 2015-05-01
  • [図書] Photo-dynamic antisense regulation by photo-cross-linkable antisense oligonucleotides2016

    • 著者名/発表者名
      Yamayoshi A., Kobori A., Murakami A.
    • 総ページ数
      10
    • 出版者
      Pan Stanford Publishing Pte. Ltd.
  • [産業財産権] ターゲット分析チップおよびターゲット分析方法2016

    • 発明者名
      村上章、小堀哲生、山吉麻子、野田雄一郎、近藤正幸
    • 権利者名
      村上章、小堀哲生、山吉麻子、野田雄一郎、近藤正幸
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      PCT/JP2016/051925
    • 出願年月日
      2016-01-22
    • 外国
  • [産業財産権] ターゲットの分析方法およびターゲット分析チップ2016

    • 発明者名
      村上章、小堀哲生、山吉麻子、野田雄一郎
    • 権利者名
      村上章、小堀哲生、山吉麻子、野田雄一郎
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2016-011018
    • 出願年月日
      2016-01-22
  • [産業財産権] エキソソームのmiRNAの機能を抑制することができる複合体複合体、がんの増殖及び/又は転移抑制剤2016

    • 発明者名
      山吉麻子、村上章、芦原英司、小堀哲生
    • 権利者名
      山吉麻子、村上章、芦原英司、小堀哲生
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特顔2016-28924
    • 出願年月日
      2016-02-18

URL: 

公開日: 2017-01-06  

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