| 研究課題/領域番号 |
15K05574
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| 研究機関 | 大阪薬科大学 |
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研究代表者 |
浦田 秀仁 大阪薬科大学, 薬学部, 教授 (80211085)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 金属錯体型塩基対 / プライマー伸長反応 / DNAポリメラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、ウラシル塩基の５位修飾（チミン塩基の５位メチル基の他の置換基への変換）が、金属錯体型塩基対を含む二重鎖DNAの安定性及びDNAポリメラーゼによる金属錯体型塩基対形成反応に及ぼす影響を明らかにしようとするものであり、平成２７年度はデオキシウリジンの５位修飾体の合成に取り組んだ。５位にethynyl, acetyl, caroxy, carbamoyl, aminoなどの置換基をもつデオキシウリジン誘導体の合成は、５―ハロゲノ(5-iodo or 5-bromo) デオキシウリジンを出発原料として達成されるため、まず、５―ハロゲノデオキシウリジンの合成に着手した。
５―ヨードおよび5-ブロモデオキシウリジンは既知化合物であり文献記載例も多くそれらを参考に合成を試みたが、ハロゲン化の反応は進行するものの単離の段階で原料に戻り５―ハロゲノデオキシウリジンは得られなかった。文献に記載されていない後処理上のコツが必要と判断し、種々検討を行った結果、５―ヨードデオキシウリジンを好収率で得ることに成功した。今後、５―ヨードデオキシウリジンを用いて上記デオキシウリジン誘導体の合成を早期に達成したい。
また、５―ハロゲノデオキシウリジンを合成中間体としない誘導体のうち５―トリフルオロメチルデオキシウリジンの合成も低収率ながら達成できており、これは５―シアノデオキシウリジンへの変換も可能な化合物である。
以上と並行して銅イオン存在下でのDNAポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応を検討し、Cu(II)イオン存在下で進行しないC-Cu(II)-T塩基対形成反応が、還元剤であるアスコルビン酸存在下ではC-Cu(I)-Tの形成を示唆する結果が得られ、金属錯体型塩基対のnet chargeがプライマー伸長反応の進行に重要な意味合いを持つことを示唆する成果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
５位修飾デオキシウリジンおよびデオキシシチジンの合成は、平成２７年度から２８年度にかけて実施する研究計画であるが、「研究実績の概要」で述べたように、５-ハロゲノデオキシウリジンの合成に長期間の検討を要したため、５位修飾デオキシシチジンの合成については未だ着手できていないのが現状であるが、５-ヨードデオキシウリジンの合成に成功し、幾つかの５位修飾デオキシウリジン誘導体の合成の目処が立ったことから２８年度は種々の５位置換デオキシウリジンおよびデオキシシチジンの合成が達成できるものと考えている。
また、銅イオン存在下でのDNAポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応を検討し、一価の銅イオンのみがC-Cu-T塩基対形成を介する伸長反応を促進することを示唆する結果が得られ、金属錯体型塩基対のnet chargeがプライマー伸長反応の進行に重要で、ピリミジン塩基を修飾することで金属錯体型塩基対を形成した際のnet chargeに影響を与え、プライマー伸長反応を制御しようという本研究の目的を金属イオンの側からのアプローチで達成したものと言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、５-ヨードデオキシシチジンの合成法を確立し、５-ヨードデオキシウリジンとともに各種５位修飾ヌクレオシド誘導体合成の鍵中間体とする。合成する５位修飾基としては、デオキシウリジン誘導体ではアシル基、ホルミル基、シアノ基、トリフルオロメチル基などの電子吸引性基を有するもの、デオキシシチジン誘導体ではヒドロキシ基、アルコキシ基、アルキルアミノ基などの電子供与性基を有するものを中心に合成を行う。さらに、それらをオリゴヌクレオチド合成ユニットであるアミダイト体に変換し、オリゴヌクレオチドへ組み込んだのち、DNA二重鎖の安定性の検討やプライマー伸長反応の鋳型鎖として用いる。合わせて、合成した修飾ヌクレオシドを5’-トリリン酸体に変換し、プライマー伸長反応に供することで、鋳型鎖５位修飾とトリリン酸体５位修飾が本プライマー伸長反応に及ぼす影響について比較する。
平成２７年度は修飾核酸の自前合成にこだわったが、今年度は研究計画の進捗を優先し、オリゴヌクレオチドのカスタム合成で購入可能な５位置換体 (5-fluoro-dU, 5-hydroxy-dC) については、これらを含むオリゴヌクレオチドを購入し、その二重鎖の熱安定性に対する金属イオンの影響について検討を行うと同時に、これらを含む鋳型鎖を購入し、そのプライマー伸長反応における金属イオンの影響について検討を始める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２７年度は研究経費の節約を考え、可能な限り化合物の自前での合成を心掛けて実施してきたが、５位修飾ヌクレオシド誘導体の合成の進捗に遅れが生じ、それにより予算の未執行が生じた。今年度は、経費節約よりも研究計画の進捗に重心を傾けた予算の執行を心掛けていく。
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| 次年度使用額の使用計画 |
「今後の研究の推進方策」で述べたように、５位修飾ヌクレオシドの合成、それらのアミダイト体への変換およびこれを用いたオリゴヌクレオチドの合成に要する試薬等の経費が必要である。また、５位修飾ヌクレオシドの３'-リン酸体への変換に要する試薬、溶媒等の経費が必要となる。さらに、オリゴヌクレオチドのカスタム合成で入手可能な５位修飾体を含むオリゴヌクレオチドの購入経費が必要である。
以上の合成関連経費に加え、必要に応じて金属イオン存在下でのプライマー伸長反応の検討全般において必要な鋳型鎖、蛍光標識プライマー、DNAポリメラーゼ、および反応の解析を行うゲル電気泳動関連の消耗品は前年度と同様である。さらに、老朽化した恒温槽やパーソナル遠心機など低額の機器の更新も必要に応じて行っていく予定である。
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