| 研究課題/領域番号 |
15K05592
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
平石 知裕 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 専任研究員 (20321804)
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| 研究分担者 |
朝倉 則行 東京工業大学, 生命理工学研究科, 講師 (40401559)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ラッカーゼ / 環境メタゲノム |
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| 研究実績の概要 |
ラッカーゼは様々な芳香族化合物を酸化する能力を有しており、染色・脱色・エンジニアリングプラスチック合成などに活用されているが、反応によっては大量の酵素が必要である。主要な市販ラッカーゼは真菌(カビ・キノコ)由来であり、異種発現による大量生産や遺伝子工学による高活性化・高機能化が難しい。さらに現在使用可能な全ての酵素は、環境中の培養可能な1 %未満の微生物から得られたものであり、残り99 %の微生物資源の有効利用が望まれている。そこで本研究では、環境試料から直接DNAを抽出してメタゲノムライブラリを作製し、ラッカーゼ活性を指標としたスクリーニングを行い、難培養微生物由来新規ラッカーゼの獲得を目指す。さらに、基質スクリーニングを行った後、機能性材料開発を目指した酵素の高性能化・高機能化を行う。
本年度は、難培養微生物由来新規ラッカーゼ獲得を目指した大腸菌を宿主としたスクリーニング系を構築した。まず、竹林を初めとする様々な環境サンプルから環境DNAを抽出・増幅した後、5 kbp程度に断片化した。次いで、断片化DNAを発現ベクターに導入した後、大腸菌を形質転換してライブラリを作製した。ラッカーゼの異種発現において、銅濃度等の発現条件の最適化が重要であるため、ラッカーゼ発現に最適培養条件の検討を行った。その後、最適条件下で培養したライブラリを用いて、ラッカーゼ活性を指標としたスクリーニングを行った。その結果、いくつかのポジティブクローンを得ることに成功した。現在、これらクローンの遺伝子解析を実施している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本申請研究では、メタゲノムスクリーニングによって難培養微生物由来の新規ラッカーゼを獲得するとともに、この酵素の進化工学による高性能化を計り、得られた人工進化酵素による機能性材料の合成反応を行うことを目標としている。
本研究では、「目的とするラッカーゼ反応に特化したスクリーニング系の構築」が重要となるが、「宿主が有するラッカーゼ活性の影響の排除」及び「培養法などのスクリーニングの最適化」に予想以上に時間がかかってしまったため、当初の予定よりやや遅れていると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度において「環境DNAメタゲノムを用いたラッカーゼスクリーニング系の構築」がほぼ達成できている。そこで、今後の研究推進方策として、当初の計画通り本システムを利用して「ラッカーゼのメタゲノムスクリーニング」を実施する。また、予備実験において大腸菌由来ラッカーゼも有用な触媒となり得ることが分かったので、本酵素の利用も平行して検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度において研究がやや遅れ気味であった結果、本年度実施予定であったハイスループットスクリーニング等に必要な機器や消耗品の購入を平成28年度に延期したために残額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度では、ラッカーゼのメタゲノムスクリーニングを行うとともに、得られた酵素の反応特性を明らかにする。そのために必要な活性測定装置や反応物精製装置を購入する予定である。一方、消耗品については比較的高額な生化学試薬が必要となる上、使い捨てのプラスチック器具を多用することになる。さらに、多数のDNA配列解析が必須であることから、その解析に使用する生化学試薬及び消耗部品の購入費用を消耗品費として計上した。このほか、成果報告発表の旅費や論文投稿費を計上している。
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