| 研究課題/領域番号 |
15K05668
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| 研究機関 | 阿南工業高等専門学校 |
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研究代表者 |
山田 洋平 阿南工業高等専門学校, 創造技術工学科, 助教 (70706936)
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| 研究分担者 |
薮谷 智規 愛媛大学, 紙産業イノベーションセンター, 教授 (80335786)
鈴木 良尚 徳島大学, 大学院理工学研究部, 准教授 (60325248)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | タンパク質結晶 / 単結晶x線構造解析 / トラックエッチドメンブレンフィルター |
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| 研究実績の概要 |
トラックエッチドメンブレンフィルター（TEMF）の細孔内のように、狭い空間内では溶液の対流が強く抑制されるとの発想に基づき、細孔内でのタンパク質結晶成長挙動やそこで成長した結晶の品質について評価する。前年度に引き続き、TEMFの細孔内で作製したリゾチーム結晶の単結晶X線構造解析を実施した。TEMFの細孔径は30マイクロメートルとし、リゾチームの結晶化溶液中にTEMFを浸漬しておくとことで、細孔内に結晶を成長させた。TEMF細孔内にある結晶の構造解析を行うために、CrystalCap System（Hampton Research社製）をベースとして二枚のワッシャーでTEMFを挟みこむマウント系を作製し、TEMFを構造解析装置に導入した。また、30マイクロメートルという微小な結晶の構造解析を行うために、SPring-8 BL38を利用して測定を行った。
測定は、常温およびクライオガスによる冷却下の二通りで実施した。その理由は、TEMFが水分を多く含むため冷却時に氷や霜が発生しやすかったこと、また、その急激な温度変化によりTEMF自体が変形した場合、結晶品質に悪影響を与える可能性があったためである。常温で構造解析を行う際には、結晶試料が乾燥しないように二枚のカプトン膜で結晶化液とTEMFを挟みこんだ。これにより、常温でも結晶の乾燥を防ぎながら測定することが可能であった。結果的には、クライオガス・常温下ともに安定して回折像を得ることができた。
得られたデータの分解能などについて今後詳細に検討していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SPring8にて年間課題として採択されたため、平成27年度に1回、平成28年度に2回の実験を行うことができた。試料のマウント系の構築については、9.実験実績の概要にて説明した通りである。結果、常温およびクライオガス冷却下でそれぞれ結晶構造解析を行い、回折像を得ることができた。一方で、TEMFの微小孔内とバルク溶液で、タンパク質結晶の核生成頻度や結晶成長速度（結晶溶解速度）に差異があるかについて、十分な実験データが得られていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
結晶生成頻度や結晶成長速度について、TEMFの細孔内とバルクで差異があるかを検証するための実験系を構築する。現状では、組成を変えた結晶化溶液を仕込んだ後、電子冷熱低温恒温器にて保管し、一定時間ごとに恒温器から取り出し、光学顕微鏡観察を行っている。顕微鏡観察下でも恒温状態を維持できる温度コントローラーを導入し、結晶成長の経過観察を行えるようにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究室内で実施可能な実験が多くを占めたため
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| 次年度使用額の使用計画 |
7月に国際学会に参加し、論文投稿予定。顕微鏡観察用温度コントローラーの導入などを行う。
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