| 研究課題/領域番号 |
15K06593
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪市立工業研究所 |
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研究代表者 |
桐生 高明 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (20416308)
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| 研究分担者 |
村上 洋 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究室長 (10416307)
木曽 太郎 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (90416313)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | セルロース / グルカル酸 / 糖酸化酵素 / β-グルコシダーゼ |
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| 研究実績の概要 |
セルロースからポリマー原料として利用可能なグルカル酸を生産する手法を確立するため、セルロースの分解物であるセロオリゴ糖を酸化し、セロオリゴアルドン酸を生産する条件の決定および、セロオリゴアルドン酸を効率よく加水分解するβ－グルコシダーゼの精製とクローニングを行っている。
Paraconiothyrium 属KD3株培養上清を用いたセロオリゴ糖酸化反応条件について検討を行った。グルコースおよびセロビオースからセロテヘキサオースまでセロオリゴ糖に対する相対活性を調べた。セロオリゴ糖の鎖長が長くなっても、培養上清に含まれるCarbohydrate:accepter oxidoreductaseはこれらのオリゴ糖を、良好な基質とされるラクトース並みに、効率的に酸化ですることが分かった。一方、グルコース酸化活性はラクトースの１割に過ぎなかった。酸化反応により生成する過酸化水素により反応効率が低下したが、過酸化水素を分解することで、反応効率の低下を回避できた。さらに、セロビオースを酸化し、セロオリゴアルドン酸を大量調製した。
Penicillium chrysogenum ATCC28089のゲノムデータベースから、β-グルコシダーゼと思われる遺伝子を８種選択、そのうちの3種を発現ベクターに導入し酵母に形質転換し、β-グルコシダーゼ導入酵母の調製を行った。
各種Penicillium属市販酵素剤について、セロビオース分解活性とセロビオン酸分解活性の比較を行った。アマノエンザイム社製の酵素剤はセロビオース分解活性よりセロビオン酸分解活性の方が高いことから、本酵素剤より、目的酵素の精製を行うこととした。硫安沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィーが目的酵素の精製に有効であることが分かった。また、各種、疎水クロマトグラフィー担体による生成を試みたが、いずれの担体も活性が失活してしまうことが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Paraconiothyrium 属KD3株培養上清については、反応条件などの検討を行った、課題となっていた、過酸化水素の影響の回避方法も確立するなど、当初の目標をおおむね達成できた。
P.chrysogenum 由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子のクローニングと発現についても複数個のβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現ベクターに組込み酵母に形質転換することができた。
市販酵素剤からの、セロビオン酸を効率的に分解するβ-グルコシダーゼの精製につても酵素剤の選択および精製条件を確立しつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は当初の計画どおりに研究を進める。具体的には、Paraconiothyrium 属KD3株由来の酸化酵素、COX遺伝子のクローニングを行い、その塩基配列を明らかにする。すべてのP.chrysogenum 由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子の酵母での発現を目指す。さらに、市販酵素剤からのβ-グルコシダーゼの精製を行うとともに、部分精製したβ-グルコシダーゼを用いたセロビオン酸に対する分解反応の諸条件について明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定より旅費が安くついたため。18,764円の未使用額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
来年度の消耗品等に使用する。
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