| 研究課題/領域番号 |
15K06593
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪市立工業研究所 |
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研究代表者 |
桐生 高明 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (20416308)
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| 研究分担者 |
村上 洋 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究室長 (10416307)
木曽 太郎 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (90416313)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | セルロース / グルカル酸 / 糖酸化反応 / β-グルコシダーゼ |
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| 研究実績の概要 |
Penicillium chrysogenum由来の市販酵素剤からセロビオン酸に対し高い分解活性を示すβ-グルコシダーゼの精製を行った。硫安沈殿の後、陰イオン交換クロマトに供することで、総タンパク質量に対するβ-グルコシダーゼ活性（セロビオン酸分解活性）の比活性は上昇したが、セロビオン酸分解活性とセロビオース分解活性を比較した場合、精製前は前者が高かったが、精製後は後者の方が高くなった。陰イオン交換クロマトによる処理は比活性の高いセロビオン酸分解酵素液を得るには適しており、今後行う予定のセロオリゴ糖の分解実験にはこの部分精製酵素を用いる。一方、この結果は、セロビオースよりセロビオン酸に対し高い分解活性を示すβ-グルコシダーゼが失活している可能性を示唆しており、目的酵素の完全精製には不向きであることがわかった。そのため、さらに、疎水クロマトやヒドロキシアパタイト等の精製法を試みたが、セロビオン酸分解活性の低下を回避することは出来なかった。目的酵素は精製により失活しやすい可能性があり、さらなる精製法の検討が必要であることが分かった。
昨年度クローニングしたP. chrysogenumの全塩基配列解明株の8つのβ-グルコシダーゼ候補遺伝子を酵母で発現させたところ。2種類のβ-グルコシダーゼを発現させることができた。
Paraconiothyrium属KD3株のセロオリゴ糖酸化酵素の遺伝子配列を決定することができた。今後、本酵素の酵母での大量発現を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
高いセロビオン酸分解活性を示すβ-グルコシダーゼPenicillium chrysogenum由来の市販酵素剤から硫安沈殿の後、陰イオン交換クロマト処理することで、セロビオン酸分解活性の比活性を上昇させることができた。また、P. chrysogenumの全塩基配列解明株由来のβ-グルコシダーゼの発現にも成功しており、おおむね順調に進展していると考えている。次年度は上記の精製法で取得した酵素や酵母で発現させた酵素を比較検討し、目的とするグルコン酸生産法の実証試験に適した酵素を選択する。
Paraconiothyrium属KD3株についてもセロオリゴ糖酸化酵素の塩基配列を決定するなど、こちらもおおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
P. chrysogenum由来の市販酵素剤からセロビオン酸に対して高い分解活性を示す酵素を部分精製した。さらに酵母でP. chrysogenum由来のβ-グルコシダーゼを発現させた。次年度は上記のの酵素の性質やセロビオン酸に対する分解活性を評価し、目的とするグルコン酸生産法の実証試験に適した酵素を選択する。また、市販酵素剤から目的酵素を電気泳動的に単一に精製するための実験を引き続き行う。
本年度に塩基配列を決定したParaconiothyrium属KD3株由来のセロオリゴ糖酸化酵素
の酵母での大量発現にも取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進捗状況により、購入予定機器の購入の必要が来年度にずれ込んだために、当初より予算が余る事態となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
先送りになった購入機器の購入と消耗品の購入に充てる。
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