研究課題
神経筋接合部（NMJ）は運動神経と筋肉細胞を結ぶシナプスで、その形態形成は運動神経が分泌するagrinの受容体であるLRP4/MuSKとその下流のシグナル伝達経路が重要であることが知られている。本研究はNMJとagrin/LRP4/MuSKに対する分泌型増殖因子の機能を知る事を目標にし、増殖因子またはそれにより活性化されるシグナル伝達経路がNMJの形態形成にどのようにかかわるのかを検討している。昨年までにヒト胎児腎細胞HEK293にagrin、LRP4、MuSKを発現させると活性化されるATF2-Lucレポーターを指標に、候補となる７つの分泌型増殖因子BMP、IGF、TGFbeta、TNF、hedgehog、VEGF、notchがagrin/LRP4/MuSKシグナルにどのように影響しているかを検討していた。その結果、TNF、VEGF、notchについてはシグナルを化合物で阻害しても、レポーターの活性化度合いに変化は一定しなかった。この結果は、NMJで特異的に発現が上昇している遺伝子群の中に、これらのシグナル伝達経路を変化させる因子が含まれていない事と一致した。一方、その他のシグナル伝達経路を活性化した場合、大小に差はあるものの、レポーターの活性化度合いに差が見られた。続いて、それ以外の増殖因子（BMP、IGF、TGFbeta、hedgehog）の筋肉細胞のアセチルコリン受容体の状態を観察する事にしたが、この実験は感度が低く、また薬剤や増殖因子の濃度の設定が難いため、未だシグナル伝達経路の促進因子と抑制因子の結果に統一性が見られていない。
2: おおむね順調に進展している
今年度の目標であった「候補となる７つの増殖因子のシグナル伝達経路がAChRの集積に影響するのかを解析する。」については、ほとんど関係がないと思われる伝達経路を特定できた。一方、次年度の目標であった「興味深いシグナル伝達経路が存在した場合には、ステップ３として各シグナル伝達経路を構成する個々の因子のNMJ形成における機能解析を行う。」という目標に対し、現在候補として残っているシグナル伝達経路に関わる因子のいくつかに対するshRNAによる阻害実験を検討し、その配列の設計中である。最終目標に対する相対的な達成度合いは「おおむね順調に進展している」と考える。
提出された研究計画に基づき、最終的に「NMJにおける増殖因子の機能を知り神経シナプス形成に対する増殖因子の生理的な役割を知るための基盤となる知識を得る」ことをめざし、shRNAや抑制薬剤などを用いた機能阻害実験を積極的に進めていく。また、リン酸化抗体を用いたウェスタンブロットや標的タンパクの発現量の確認など、比較的白黒がつけやすい実験方法を用いて各増殖因子の役割を比較・検討をしていきたい。
本年度はウィルスベクターなどの作製を行わなわず、化学化合物などを用いたため、分子生物学的な実験に用いる消耗品の購入がほとんどなかった。
本年度は、物品費はshRNAの作製費用、新規の実験方法の施行費に充てていく。また、使用額に計上した旅費を用い、この結果を海外の学会で報告していく。
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