ATBF1ノックアウトマウスを用いた神経細胞死とAPPの細胞内運送機構の解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K06714
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 鄭 且均 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (00464579)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: アルツハイマー病 / ATBF1 / APP代謝 / Aβ産生 / 神経細胞死

研究実績の概要

アルツハイマー病（AD）の原因遺伝子であるアミロイド前駆体タンパク質(APP)が、細胞内運送の異常を起こすことでAβ産生が制御され、ADの発症に深く関わっている。また、重合体Aβが中枢神経系でDNAダメージやシナプス障害を引き起こすことで神経細胞死が起こると想定されるが、Aβの神経障害機構の詳細は未確定である。本研究では、ATBF1ノックアウトマウスを用いて神経細胞死及びAPP細胞内運送におけるATBF1の機能を動物レベルで明らかにすることを目的とする。
前年度までには、ATBF1 ノックアウトマウス由来神経細胞をAβで刺激すると、野生型マウス由来神経細胞と比べて神経細胞死が抑制されることがわかった。また、神経細胞死を増加させるATBF1のターゲット分子を探すため、妊娠１６日目の野生型およびATBF1 ノックアウトマウスの脳から神経細胞を分離・培養し、Aβ刺激後、cDNA microarray法を用いて変動する遺伝子の解析を行った。本年度には、cDNA microarray法で得られた候補ターゲット遺伝子の発現をReal-time PCRで確認を行った。その結果、細胞死に関連するBcl2ファミリーの遺伝子群の変動が見られた。すなわち、ATBF1はBcl2の発現を抑制することによってAβ刺激により引き起こされた神経細胞死を増加させることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の研究計画は、①神経細胞死を増加させるATBF1のターゲット分子の同定と、②ATBF1ノックアウトマウスとADモデルマウスであるJ20マウスの交配マウスを用いてAPP細胞内運送およびAβ産生におけるATBF1の機能解析の実験計画を立てて行う予定であった。
まず、神経細胞死を増加させるATBF1のターゲット分子の同定は計画とおり行い、野生型およびATBF1 ノックアウトマウスの脳から神経細胞を分離・培養し、Aβ刺激後、cDNA microarray法を用いて変動する遺伝子の解析で得られた候補ターゲット遺伝子の発現をReal-time PCRで行った。その結果、 ATBF1はBcl2の発現を抑制することによってAβ刺激により引き起こされた神経細胞死を増加させることがわかった。しかし、APP細胞内運送およびAβ産生におけるATBF1の機能解析では、ATBF1ヘテロ (+/-)とJ20マウスの交配マウスは生後直後で死亡ことが多いため実験が少し遅れている。現在、別のADモデルマウスであるAPP-KIマウスとATBF1ヘテロ (+/-)の交配マウスを作成している。

今後の研究の推進方策

１）神経細胞死におけるATBF1の機能解析；ATBF1はBcl2の発現を抑制することによってAβ刺激により引き起こされた神経細胞死を増加させることがわかったので、Bcl2発現を制御するメカニズムを解析する。まず、Bcl2 promoterを用いてATBF1の過剰発現によるBcl2 promoterの活性化を測定する。また、細胞にATBF1をノックアダウンさせ、Bcl2のmRNA及びタンパク質レベルを測定する。
２）APP細胞内運送およびAβ産生におけるATBF1の機能解析；現在作成中であるATBF1ヘテロ (+/-)とAPP-KIマウスの交配マウスを用いて次の実験を行う。
①　脳の形態を調べる。②　Aβ量の解析；脳組織からAβ量をELISA法で定量する。③　APPの細胞内局在を検討する；脳標本を用いてAPPの局在をAPP抗体とゴルジ体、エンドソーム、ライソゾーム特異的な抗体を用いて二重蛍光染色することで確認する。④　脳組織またはこのマウスから神経細胞を分離し、分子病態に関連する分子群の発現量をreal-time PCR及びウェスタンブロティングにより定量する。

研究成果

• [国際共同研究] Cellular Aging and Neurodegeneration/Ilsong Institute of Life Science/Hallym University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Cellular Aging and Neurodegeneration/Ilsong Institute of Life Science/Hallym University
• [国際共同研究] Department of Microbiology/College of Medicine/Hallym University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Department of Microbiology/College of Medicine/Hallym University
• [雑誌論文] Dysfunction in motor coordination in neonatal white matter injury model without apparent neuron loss (2016)
  • 著者名/発表者名: Misumi S, Ueda Y, Nishigaki R, Suzuki M, Ishida A, Jung CG, Hida H.
  • 雑誌名: Cell Transplant 巻: 25 ページ: 1381-1393
  • DOI: 10.3727/096368915X689893
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A diagnostic marker for superficial urothelial bladder carcinoma: lack of nuclear ATBF1 (ZFHX3) by immunohistochemistry suggests malignant progression (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi M, Hara N, Bilim V, Koike H, Suzuki M, Kim TS, Gao N, Dong Y, Zhang S, Fujinawa Y, Yamamoto O, Ito H, Tomita Y, Naruse Y, Sakamaki A, Ishii Y, Tsuneyama K, Inoue M, Itoh J, Yasuda M, Sakata N, Jung CG, Kanazawa S, Akatsu H, Minato H, Nojima T, Asai K, Miura Y.
  • 雑誌名: BMC Cancer 巻: 18 ページ: -
  • DOI: 10.1186/s12885-016-2845-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Protection of ATBF1-mediated Neuronal Cell Death by Cellular Prion Protein (2016)
  • 著者名/発表者名: Han SS, Choi HS, Park JH, Kim HJ, Jun YC, Kim YS, Jung CG, Choi EK
  • 学会等名: ２０１６年韓国人老人科学学術団体連合会学術第会
  • 発表場所: ソウル（韓国）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-25
• [学会発表] Cellular Prion Protein Inhibits Cell Death via Regulation of ATBF1 and Its Related Signaling Pathway (2016)
  • 著者名/発表者名: Han SS, Choi HS, Park JH, Kim HJ, Jun YC, Kim YS, Jung CG, Choi EK
  • 学会等名: 2016年第２４回基礎医学学術第会
  • 発表場所: 仁川（韓国）
  • 年月日: 2016-06-24 – 2016-06-24