| 研究課題/領域番号 |
15K06727
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
今野 大治郎 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 研究員 (00362715)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、Shhの条件的遺伝子欠損マウスと、申請者らがこれまでに作製したDmrt3およびDmrta2遺伝子の条件的二重欠損マウスとの組み合わせにより、Dmrt3/Dmrta2の機能におけるShhシグナルの関連性を検討した。具体的には、Dmrt3/Dmrta2遺伝子の条件的欠損マウスと、Shh遺伝子の条件的欠損マウス交配し、さらにこれらとNestin-Creマウスを交配させることにより得られた条件的三重欠損マウスの表現型を解析した。我々のこれまでの研究から、Dmrt3/Dmrta2遺伝子欠損マウス胎仔では、大脳皮質領域において異所性なGABA作動性ニューロンの産生が認められることが明らかとなっているが、上記の条件的三重欠損マウスにおいては表現型の顕著な回復（レスキュー）は認められなかった。これらの結果は、 Dmrt3/Dmrta2が抑制している大脳皮質領域の腹側化シグナルは、大脳皮質領域腹側化抑制分子であるPax6が制御するShhシグナルなどとは異なるものであり、新しい背側維持機構の存在を示唆している。そこで今後は、樹立に成功したDmrt3/Dmrta2二重遺伝子欠損ES細胞に試験管内分化培養法を応用し、変異ES細胞を大脳新皮質神経前駆細胞に分化させ、変異細胞における分化状態を免疫組織化学的方法や遺伝子発現の網羅的解析することで、Dmrtが制御する大脳神経前駆細胞の個性獲得・維持機構の解明を試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今回の条件的遺伝子欠損マウスの実験にはNestin-Creマウスを用いたが、Nestin-Creマウスの大脳領域におけるCre遺伝子の発現は胎生中期（胎生10-11日齢前後）より顕著に認められるようになる。よってDmrt3/Dmrta2/Shh遺伝子の条件的三重欠損マウスにおける表現型が、Nestin-Creを用いたDmrt3/Dmrta2遺伝子の条件的二重欠損マウスとほぼ変わらないという結果は、Creが機能するタイミングが遅すぎることが原因である可能性が考えられた。そこで、Cre発現マウスを、大脳領域での発現がNestin-Creマウスより早い時期に認められるEmx1-Creマウス（胎生9日齢前後）に変更し、また、Shhシグナルの機能阻害をより確実にするため、Shh遺伝子条件的欠損マウスを、Shhシグナル伝達分子であるSmoothenedの条件的遺伝子欠損マウスに変更した。その結果、これらの条件的三重欠損マウスの表現型は、前述のNestin-Creマウスを用いたDmrt3/Dmrta2/Shh遺伝子条件的三重欠損マウスと比べてより重篤であったが、Emx1-Creマウスを用いたDmrt3/Dmrta2遺伝子の条件的二重欠損マウスの表現型とほぼ同一であった。これらの結果は一部当初の予想と異なるものであったが、適宜使用マウスを変更することで解析が順調に進行した。その結果として、Shhシグナルとは異なる分子メカニズムが大脳皮質領域の腹側化に関与しており、Dmrtがそれらを抑制しているという新しい分子メカニズムの存在の発見に至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、初年度に樹立に成功したDmrt3/Dmrta2二重遺伝子欠損ES細胞と試験管内分化培養法（SFEBq法）との組み合わせにより、遺伝子欠損ES細胞を大脳新皮質神経前駆細胞に分化誘導させ、変異細胞において発現が変動する遺伝子を網羅的に解析することで、Dmrtが制御する分子機構の解明を試みる。また、Dmrt3遺伝子の条件的強制発現マウスの樹立にも成功したことから、実験計画に従い、Dmrt遺伝子の強制発現および遺伝子機能欠損マウスにおける大脳皮質領野形成への影響を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
各種遺伝子欠損マウスを用いた実験において予想外の成果が得られたことから、実験計画を一部修正する必要が生じたため。
加えて、それらの結果が年度の後半に得られたため、変更後の研究計画における物品の購入が年度を跨がないよう配慮する必要性が生じたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験計画の微修正に伴う購入試薬等の再選定を速やかに実施するとともに、当初の実験計画に必要な試薬と併せて、研究計画の遂行に支障が生じないよう予算の適正な使用に努める。
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