| 研究課題/領域番号 |
15K06727
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
今野 大治郎 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 研究員 (00362715)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、Dmrt3/Dmrta2二重欠損ES細胞を用い、Dmrt3/Dmrta2がどのようなシグナル伝達経路を調節することで神経前駆細胞における大脳背側アイデンティティーを維持しているかを解析した。我々のこれまでの研究から、Dmrt3およびDmrta2遺伝子を同時に欠損させたマウスの大脳皮質神経前駆細胞では、大脳腹側神経前駆細胞の運命決定に必須の分子であるGsx2の異所的な発現上昇が認められ、Shh非依存的な新規の腹側化メカニズムの存在が示唆された。そこで、これらのメカニズムが外因性（extrinsic)もしくは内因性（intrinsic)のどちらの因子で制御されているのかを明らかにするため、In vivoで認められた細胞運命の腹側化が、In vitro分化培養系（SFEBq法）においても再現されるかどうかを検討した。その結果、In vitro分化培養系においては、Dmrt3/Dmrta2遺伝子二重欠損細胞においても野生型細胞と同様に、Pax6やEmx1/2などの大脳皮質神経前駆細胞マーカーの正常な発現が認められた。これらの細胞では、Gsx2など大脳腹側神経前駆細胞マーカーの発現は全く認められなかったことから、二重欠損マウスにおいて認められた背側領域の運命転換は、何らかの細胞外シグナルに依存していることが明らかとなった。我々のこれまでの研究から、これら運命転換の表現型には、腹側化シグナルとして知られているShhシグナルは関与していないことが明らかとなっている。そこで、FgfやTgf-betaシグナルなど、他の腹側化シグナルの関与も検討したが、現在のところ、上記のシグナル伝達機構が、Dmrt3/Dmrta2遺伝子欠損マウスにおける表現型の出現に関与する証拠は得られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ES細胞の分化培養を用いた細胞運命決定・維持メカニズムの解析において、培地の組成が細胞運命の決定に及ぼす影響を最小限にとどめながら再現性の高い実験系を構築することは、得られる結果の解釈を単純化するために最も重要な要素の1つである。我々がES細胞分化培養系に用いたSFEBq法は、成長因子の添加を行わずにES細胞を大脳皮質領域細胞へ分化させることが出来ることから、我々の目的に最も適した分化培養系であると考える。しかしながら、我々の予備的な実験から、SFEBq法を用いてDmrt3/Dmrta2二重欠損ES細胞を分化させた場合、野生型ES細胞を用いた場合に比べ、細胞の分化様式が実験ごとに異なりやすいことが明らかとなった。今年度はその原因の同定に時間を要したことで、全体の実験計画の進行がやや遅れることとなった。最終的に、その原因が培地に添加するマトリゲルにあることが判明し、SFEBq法からマトリゲルを除いた変法を用いることで、再現性の高い結果が得られた。そこで次年度は、分化培養法をこのSFEBq変法に変更したうえで、当初の実験計画の行程に従って実験を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
SFEBq法からマトリゲルを除いた変法を用いることで、再現性の高い結果が得られたため、今後は分化培養法をこのSFEBq変法に変更したうえで、当初の実験計画の行程に従って実験を進める。具体的には、Dmrt3/Dmrta2二重欠損ES細胞および野生型ES細胞を、SFEBq変法により大脳皮質神経前駆細胞へ分化誘導し、それら細胞を用いた遺伝子発現プロファイリングにより、変異細胞において発現が変動する遺伝子を網羅的に解析する。それらの結果を、Dmrt3/Dmrta2二重欠損マウスのIn vivoサンプルから得られた遺伝子発現プロファイルと比較することで、In vivoのみに存在するShh非依存的腹側化因子の同定を試みる。これらShh非依存的な腹側前駆細胞の運命決定・維持機構は、大脳の発生過程を理解するうえで非常に重要なメカニズムでありながらも、その詳細は明らかになっていない。そこでDmrt3およびDmrta2が制御する分子機構の解明を手がかりとして、大脳神経前駆細胞における背腹軸の形成メカニズム、さらには獲得された細胞運命アイデンティティーを維持する機構の全容解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスES細胞を用いた分化培養系の実験計画において予想外のトラブルが生じ、その原因究明に時間を要したことで、遺伝子組換マウス個体を用いた実験の実施が翌年度にずれ込むこととなった。その結果、実験試薬および物品の購入計画を一部変更する必要が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験計画の修正に伴う購入試薬・機器等の再選定を速やかに実施するとともに、当初の実験計画に必要な経費と併せて、研究計画の遂行に支障が生じないよう予算の適正な使用に努める。
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