研究課題
動物には経験や学習などに基づかない本能行動がみられることから、その一連の行動を制御する神経回路が発生期に形成されることが考えられる。私たちはこれまで、膜タンパク質Dpy19L1について注目してきたが、新たに作製したDpy19L1ノックアウトマウスは恐怖・不安反応が著しく減弱していることを見出した。そこで本研究では、Dpy19L1の分子機能とその遺伝子異常による脳構築、さらに恐怖関連行動など個体の行動をいかに決定するかを解明することを目的としている。現在、以下の研究計画を進行中である。① 天敵であるキツネ排泄物の臭い成分TMTを用いたマウス行動実験を実施した結果、Dpy19L1ノックアウトマウスはTMTに対する逃避行動が著しく低下していることがわかった。さらに、組織学的解析により、恐怖・不安反応に深く関わる中隔核後部（三角中隔核・前交連床核）に著しい細胞構築異常が生じていることを見出した。また、胎生期においても中隔核神経細胞が産生される大脳腹側部に神経細胞の分布異常が観察された。② Dpy19は膜タンパク質と予想されている。そこで、COS-7細胞にDpy19L1-GFPを発現させ、細胞内局在を検討したところ、核周囲に強く、細胞質では網目状の局在を示した。さらにこの局在は小胞体マーカーと同局在することがわかった。またマウス胎仔期大脳皮質神経細胞の初代培養を作製し、局在を検討した結果、COS-7と同じくDpy19L1は小胞体に多く分布することがわかった。培養神経細胞において、siRNAを用いたノックダウン実験を行った結果、軸索伸展が著しく阻害されることがわかった。これらの結果から、Dpy19L1は中隔核の神経回路網形成に関わり、さらにマウス個体が示す先天的な恐怖行動の誘発に深く関わっていることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
実験計画 ①Dpy19ノックアウトマウスを用いた個体レベルでの解析はおおむね計画通りに進展している。平成27年度は、Dpy19L1ノックアウトマウスが示す本能的な恐怖行動異常を行動解析により実験的に示すことができた。また、組織学的にもノックアウトマウスの大脳辺縁系において、神経核の形成異常を新たに見出した。さらに同様の表現型を胎生期においても観察することができ、この点からも順調に研究を遂行できていると考えられる。実験計画 ②培養細胞を用いたDpy19L1の細胞内局在および機能解析についても、おおむね計画通りに進行することができている。これらは主に培養細胞を用いた実験であるため、計画に遅れることなく、研究を遂行することができた。この結果は現在論文投稿準備中である。
平成28年度は以下の実験計画を進める。その中でも、本年度は実験計画①の組織化学的手法によるDpy19ノックアウトマウスの表現型解析を中心に進める。実験計画 ① Dpy19L1ノックアウトマウスにおける中隔核形成異常：Dpy19L1ノックアウトマウスを用いた組織化学的解析により、これまで中隔核にみられた細胞構築異常の詳細な解析を行う。さらにこの領域の細胞系譜はこれまで明らかにされていないため、中隔核神経細胞の細胞系譜解析を行う。実験計画 ② Dpy19L１の分子機能解析：これまで培養神経細胞において、siRNAを用いたノックダウン実験により軸索伸展が著しく阻害されることがわかった。そこでDpy19L1ノックアウトマウスから初代培養を作製し、軸索伸展異常などの形態異常が観察されるかを検討する。また、Dpy19L1の結合タンパク質の検索を行う。
Dpy19L1ノックアウトマウスの組織化学的解析において、予定した匹数より少数のマウスの使用で新たな異常を見出すことができた。そのため、平成27年度のマウスの飼育費が削減されることになった。しかしながら、その結果を検証するために新たなCreドライバーマウスを用いる必要が生じた。
使用するCreマウスはすでに導入済みである。このマウスを2ケージ、一年間維持するために使用することを計画している。
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Ann. Neurol.
巻: 78 ページ: 375-386
10.1002/ana.24444.
