| 研究課題/領域番号 |
15K06743
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
辰巳 晃子 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (90208033)
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| 研究分担者 |
森田 晶子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (70647049)
和中 明生 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (90210989)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Olig2 / アストロサイト / 大脳基底核 / 光遺伝学 / アデノ随伴ウイルス |
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| 研究実績の概要 |
これまでに我々は、生理的な条件下でマウスに運動負荷を与えて神経活動を活性化させると、大脳基底核回路を形成する神経核のひとつである淡蒼球において、グリア前駆細胞由来アストロサイトがダイナミックに形態を変化させて複雑な構造に変化することを見出した(論文投稿中)。これは神経活動とアストロサイトの活性化が密接に関連している事を強く示唆している。これらの解析にはOlig2プロモーターを用いて膜移行型GFPをグリア前駆細胞に発現させるトランスジェニックマウス(Olig2-CreER；ROSA26-flox-stop-GAP43EGFP)を用いてきた。本申請では淡蒼球アストロサイトと神経活動の関係解明を光遺伝学の手法を用いて解明する事を目的として、Olig2細胞がタモキシフェン誘導性にチャネルロドプシンを発現するマウス(Olig2-CreER；ROSA26-flox-stop-ChR2-EYFP)、あるいはハロロドプシンを発現するマウス(Olig2-CreER；ROSA26 -flox-stop-eNpHR3-EYFP)を作成した。これらのマウスを作成する上でOlig2由来アストロサイトが成熟脳において脳のいくつかの神経核に局在する事、この局在性がタモキシフェン誘導時期により異なる事を見出した。アストロサイトのheterogeneityに関しては近年注目されているが、この事はOlig2由来アストロサイトがアストロサイトのひとつのサブタイプを構成しており、神経活動依存的に特定の機能を持つ可能性を示唆していると考えられ意義深い。
また今年度は光遺伝子発現領域をより特異的に制限するために、トランスジェニックマウスのほかに、Olig2-CreERマウスにアデノ随伴ウイルス（AAV-CMV-Flex-ChR2-EGFP, AAV-CMV-Flex-Arch-EGFP）の局所投与も検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Olig2細胞がタモキシフェン誘導性にチャネルロドプシンを発現するマウス(Olig2-CreER；ROSA26-flox-stop-ChR2-EYFP)、あるいはハロロドプシンを発現するマウス(Olig2-CreER；ROSA26 -flox-stop-eNpHR3-EYFP)の作成は交配により完成したが、タモキシフェン投与時期により目的のアストロサイトの特定神経核への集積度合いが異なる事を見出した。これは神経活動依存的であるか、それともTGマウスの個体差なのか、詳細を検討している。
また、TGマウスに組換え率等の個体差がある可能性も考え、さらには光遺伝子発現領域をより特異的に制限するために、Olig2-CreERマウスにアデノ随伴ウイルス（AAV-CMV-Flex-ChR2-EGFP, AAV-CMV-Flex-Arch-EGFP）の局所投与も検討した。ウイルス使用による承認実験の申請に時間を要した事の他に、アストロサイトへのAAVの感染の効率効率が予想外に低く、AAVのプロモーターの選択、タモキシフェン投与時期など詳細な条件検討を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記記載どおりTGマウス或いはAAV投与法の検討の結果、より効率よくOlig2細胞に光タンパク質を発現する方法論を決定する。その上で当初の計画どおりに淡蒼球へカニューレを留置、光ファイバーを挿入により青色レーザー光(ChR2刺激)或いは黄色レーザー光(NpHR刺激)の照射条件を検討する。アストロサイトは神経細胞と異なりChR2による陽イオンの細胞内流入により細胞内Caイオンの上昇は簡単に起こらないことが想定されるので、レーザー光の強度、照射頻度、時間を変化させて動物の行動の変化を詳細に解析する。
行動変化が見られる条件が設定できれば神経活動を電気生理学的に検出する。光刺激を行った側とその対側にそれぞれ電極を刺入しフィールド活動を検出する。また淡蒼球の出力先である視床下核や黒質網様体部の神経活動も検討し、左右差が存在するか否かを検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究進捗が予定よりやや遅れており、予定していた試薬・マウス維持費用などが使用されなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在検討しているアデノ随伴ウイルスは譲渡によりその条件検討を行っている。今後は市販のAAVやコントロールベクターなど購入を予定している。
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