| 研究課題/領域番号 |
15K06763
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
渡部 和彦 公益財団法人東京都医学総合研究所, 運動・感覚システム研究分野, 副参事研究員 (30240477)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 運動ニューロン / TDP-43 / FUS / 筋萎縮性側索硬化症 / 凝集体 / 組換えウイルス / プロテアソーム / オートファジー |
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| 研究実績の概要 |
我々はこれまで，TDP-43, FUS cDNAや蛋白分解系を阻害するshRNAを発現する組換えアデノウイルスをラット，マウス末梢神経に混合接種し，ウイルスの軸索内逆行輸送により運動ニューロンに細胞質内凝集体を形成しうることを報告した．さらに，より長期間安定した遺伝子導入発現が可能な組換えアデノ随伴ウイルス9型(AAV9)を用いて運動ニューロン細胞体に同様の凝集体形成を認めた．そこで，ヒト正常TDP-43をEGFPとともに発現する組換えAAV9を１日齢ICRマウスの側脳室に注入接種し，脳脊髄における外来性TDP-43の長期発現を検討したところ，接種2,4週～6ヶ月後にわたって大脳，脳幹，脊髄に瀰漫性にEGFP陽性ニューロンを認めた．今後，このマウスにヒトTDP-43および蛋白分解系阻害shRNA組換えアデノウイルスを追感染させて局所の運動ニューロンにヒトTDP-43凝集体を形成させ，凝集体が周囲の細胞にヒトTDP-43を介して伝播していくか否かを経時的に観察する予定である．
一方，培養ラット神経幹細胞由来ニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトに，ヒト正常またはC末断片TDP-43をDsRedとともに発現する組換えアデノウイルスを共感染させ，プロテアソーム阻害剤MG-132を負荷すると，タイムラプス蛍光撮影で12時間後よりDsRed陽性TDP-43凝集体が細胞質に徐々に充満し，やがて細胞膜の破綻とともに細胞死に至り，残存した不溶性の凝集体が長時間浮遊する像が観察された．この凝集体はsarkosyl不溶性の顆粒状構造物からなり，リン酸化TDP-43を含んでいた．また細胞外に放出された凝集体が隣接する細胞に取り込まれる像も観察された．現在，凝集体の細胞間伝播の可視化に関しても検討を行っている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．組換えアデノウイルス，AAV9，レンチウイルスの作製：① ALS関連遺伝子のクローニング；ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43，正常および変異FUS, SOD1, VCP, UBQLN2をそれぞれDsRed発現ベクターにクローニングした．② shRNA発現ベクターの作製；蛋白分解系に関与する遺伝子 (PSMC1，VPS24，ATG5, ATG7) の発現を阻止しうるラット・マウスshRNA配列をshRNA/EGFP発現ベクターにクローニングした．③ 組換えウイルスの作製；上記①②のcDNA/DsRed, shRNA/EGFP断片を発現する組換えアデノウイルス，AAV9，レンチウイルスを作製した．
２．培養運動ニューロン・グリア細胞における凝集体形成と細胞死の解明：マウスES細胞，ヒトiPS細胞から分化させた運動ニューロンに，上記組換えウイルスを感染させた．一方，ラット成体神経幹細胞由来分化ニューロン・グリアにも感染を試みた．感染細胞はDeltaVision (GE)により15分ごと72時間のタイムラプス蛍光撮影を行い， DsRed陽性凝集体の形成過程と細胞死を観察した．感染細胞は随時固定または回収し蛍光免疫染色，ウェスタンブロット解析を行った．
３．成体マウス・ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：成体マウス・ラットの顔面神経，坐骨神経に上記組換えウイルスを単独または複数の組み合わせにより注入接種し，組換えウイルスの逆行輸送による運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を確認し，細胞質凝集体の形成に成功した．また，ヒト正常TDP-43を発現する組換えAAV9を１日齢ICRマウスの側脳室に注入接種し，脳脊髄における外来性TDP-43の長期発現を認めた．
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| 今後の研究の推進方策 |
１．培養運動ニューロン・グリア細胞における凝集体形成と細胞死の解明：前年度に引き続き，ES細胞由来分化運動ニューロン，ヒトiPS細胞由来分化運動ニューロン，ラット神経幹細胞由来分化ニューロン・グリア細胞培養系に組換えアデノウイルス，AAV9，レンチウイルスを感染させ，凝集体の形成過程を経時的にタイムラプス蛍光撮影，蛍光抗体法，免疫電顕により解析する．また，ラット神経幹細胞由来分化ニューロン・グリア細胞培養系に，ニューロン(beta-III tubulin)，アストロサイト (GFAP)，オリゴデンドロサイト (CNP) 特異的なプロモーター下にDSRed/ALS関連遺伝子を発現する組換えウイルスを感染させ，各細胞におけるDsRed陽性凝集体の形成と細胞死の相違点およびニューロン・グリア細胞間の凝集体伝播を引き続き解析する．
５．成体マウス・ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：前年度に引き続き，組換えウイルスの逆行輸送による運動ニューロンの凝集体形成解析をすすめる．また，ヒト正常TDP-43を発現する組換えAAV9を１日齢ICRマウスの側脳室に注入接種し，脳脊髄における外来性TDP-43を長期発現させたマウスに，ヒトTDP-43および蛋白分解系阻害shRNA組換えアデノウイルスを追感染させて局所の運動ニューロンにヒトTDP-43凝集体を形成させ，凝集体が周囲の細胞にヒトTDP-43を介して伝播していくか否かを経時的に観察する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた組換えAAV9およびレンチウイルスの作製に時間を要したため，組換えウイルス作製完了に伴う培養細胞実験および動物実験を次年度に行う必要がある．
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| 次年度使用額の使用計画 |
培養細胞実験および動物実験に必要な備品，消耗品費（計1,093千円）；実験動物として，3-4ヶ月齢ICRマウス200匹，妊娠雌マウス20匹，3-4ヶ月齢Fischer 344雄ラット30匹の購入に計300千円．物品費として，低速遠心機20万円，細菌培養シャーレ用保温庫10万円の計300千円．器具消耗品費としては培養基材，チューブ，ピペットなどに計493千円を計上．
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