| 研究課題/領域番号 |
15K06773
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
大塚 俊之 京都大学, ウイルス研究所, 准教授 (20324709)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | 神経幹細胞 / 神経発生 / 脳形態形成 / Hes |
|---|
| 研究実績の概要 |
BACクローン及びhuman cDNA libraryからクローニングしたhuman HES1, HES4 (variant 1 and variant 2), HES5 の発現ベクターを作製し、強制発現実験を行った。in utero electroporation法を用いて発現ベクターをマウス胎児の大脳皮質領域の細胞に導入し、神経幹細胞の維持・増殖・分化における機能解析を行った。脳室周囲帯の細胞にHES1,4,5を発現させると、いずれもニューロン分化が抑制され、導入細胞の多くは皮質板に遊走せず脳室周囲帯から脳室下帯に留まっていた。またHES4のプロモーター領域 (3.1kb, 6.5kb, 9.5kb) をクローニングし、 luciferase reporter plasmid に組み込んで作製したレポーターベクターを用いて解析を行った結果、HES4はHES1同様に、negative feedbackにより自身のプロモーター及びHes1プロモーターを抑制することを確認した。
カニクイザル胎児脳においてHES1, HES4のmRNAの発現をin situ hybridization法により解析し、HES1, HES4ともに脳室周囲帯における発現を認めたが、HES4抗体 (MBLに依頼して作製) を用いてHES4蛋白の発現を解析したところ、mRNAの発現が高い後脳領域においてはHES4抗体による染色像が得られたものの、終脳等発現が低い領域では検出が困難であった。
更にTet-ONシステムを用いて、脳の神経幹細胞においてHes1またはHes5を高発現するトランスジェニックマウスの解析を行い、Hes1, Hes5の高発現によりニューロン分化が抑制され神経幹細胞が維持された結果、脳室が拡大し皮質板が菲薄化する表現形が認められた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Human HES1, HES4 (variant 1 and variant 2), HES5 の機能解析に関しては、Notch シグナルによるHES4プロモーターの活性化、negative autoregulationの活性等が確認された。in utero electroporation法を用いたマウス胎児脳における強制発現実験により、HES1, HES4, HES5いずれもニューロン分化抑制・神経幹細胞維持活性が確認された。カニクイザル胎児脳におけるHESの発現解析は、胎齢42, 47, 51,55日の胎児脳におけるmRNAの発現をin situ hybridization法により検討し、HES1, HES4ともに脳室周囲帯における発現を確認した。蛋白発現に関してはHES1抗体以外に有用な抗体が未だ得られていない。HES4抗体を用いてHES4蛋白の発現を解析したところ、mRNAの発現が高い後脳領域においてHES4抗体による染色像が得られたが、終脳等発現の低い領域では検出が困難であった。また、胎齢51-55日頃の大脳皮質領域において、OSVZ (outer subventricular zone) にPAX6陽性細胞の増加を認めた。Tet-ONシステムを用いたHes1, Hes5強制発現マウスの解析は予定通り進んでおり、Hes1強制発現マウスにおいては、胎生期及び生後脳における神経幹細胞の維持効果を認めている。更に、Cyclin D1/Cdk4強制発現マウスおよびhuman HES4の強制発現マウスを作製し、解析を進めている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後ヒトの神経幹細胞株 (human NS cells) およびヒトiPS細胞の神経分化誘導過程におけるHESの発現動態解析を進める予定である。Human HES1, HES4 (variant 1 and variant 2), HES5 の発現解析に関しては、更にカニクイザル胎児のサンプル得て、細かいステージ別発現パターンの解析を進めたい。HES4, HES5に関しては現在のところ有用な抗体が得られておらず、更なる探索あるいは新規作製を検討する。
Tet-ONシステムを用いたトランスジェニックマウスに関しては、mouse Hes1, Hes5強制発現マウスに加えて、Cyclin D1/Cdk4強制発現マウスおよびhuman HES4強制発現マウスの解析を進めるとともに、HesとCyclin D1/Cdk4を共発現するマウスを作製してその表現形の解析を進める。
更に、Hes1プロモーター活性を制御する可能性のある化合物の探索を進め、既に得られた候補化合物と併せてHesの発現量あるいは発現パターンに影響を与える化合物の同定と詳細なメカニズムの解析を進める予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は次年度以降行う予定であったCyclin D1/Cdk4強制発現マウスおよびhuman HES4強制発現マウスの作製と解析を前倒しして行い、動物を使った実験を中心に進めた。培養細胞を用いた解析（ヒトの神経幹細胞株およびヒトiPS細胞の神経分化誘導過程におけるHES因子の発現動態解析、化合物スクリーニングおよび活性解析）は一部のみ行なったため、高額な培養試薬等の購入は次年度以降に回す形となった。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は主に細胞培養試薬 (human NS cells, human iPS cells培養用)、リアルタイムPCR用試薬、候補化合物の購入等に用いるほか、消耗品（分子生物学用試薬・免疫組織（細胞）化学用試薬（各種抗体等）・実験動物（マウス購入・維持費用）・プラスチック製品等）に使用する。また一部はデータ整理及び成果発表にかかる費用（データ印刷・複写費、現像・焼付費、学会参加のための国内旅費）として使用する予定である。
|
