研究課題
本研究課題は、申請者らが近年、小脳プルキンエ細胞で発見した、カルシウム(Ca2+)放出チャネルの一種、１型リアノジン受容体が一酸化窒素(NO)によるS-ニトロシル化を受け活性化することで起こる新規細胞内Ca2+放出機構、「NO依存的Ca2+放出(NICR)」に着目し、S-ニトロシル化を受けない変異型リアノジン受容体を発現するノックインマウスの発現型、及び酸化シグナルによるNO依存的Ca2+放出の阻害機構の解析により、この新規Ca2+放出機構の脳における機能的役割と阻害機構を明らかにし、タンパク質のS-ニトロシル化/酸化修飾による神経機能制御機構の解明を進めるとともに、その破綻に起因する疾患の同定・予防・治療へと繋がる基礎的知見を得ることを目標に立案されたものである。平成２７年度は、この新規Ca2+放出機構の機能的役割解明を主要な目的に、3636位のシステインをアラニンに置換したリアノジン受容体を発現するノックインマウス(C3636Aマウス)の表現系解析を、分子・細胞・シナプスで行うことを計画した。このためには、先ず、解析を行うために、ノックインマウスを交配し、個体数を増やす必要がある。ノックインマウスは、既にヘテロ個体が作成済みであったが、その後、交配が予想以上に順調に進んだ。そこで、当初の計画通り、分子、細胞、シナプスレベルでのノックインマウスの表現型解析を行った。その結果、「現在までの進捗状況」欄に具体的に記したように、ほぼ予想していた通りの結果を得ることが出来た。さらに、交配が順調に進んだため、平成２８年度に予定していた個体レベルでの解析の一部に関しても、予備的な実験に着手することが出来た。
2: おおむね順調に進展している
平成２７年度は、NICRの機能的役割について、主に細胞・シナプスで明らかにするため、NICRに必要な3636位のシステインをアラニンに置換した変異型リアノジン受容体を発現するノックインマウス(以下、ノックインマウス)を用いて、NICRが神経系の機能に及ぼす影響について解析した。ノックインマウスは正常に出生、成熟し、NICRに必要なリアノジン受容体１、nNOSの小脳におけるタンパク発現量には有意差は見られなかった。しかしながら、ビオチンスウィッチアッセイ法による解析により、変異型リアノジン受容体１のS-ニトロシル化に阻害が確認された。次にCa2+放出について調べたところ、WTプルキンエ細胞で見られるNOドナー、NOC7により誘導されるCa2+上昇、NICRは、ノックインマウスのHet個体では半分程度、Homo個体ではほぼ完全に阻害された。一方で、同じリアノジン受容体のカフェインに対するCa2+応答には、ノックインマウスでも阻害は見られず、ノックインマウスプルキンエ細胞では、NICRの特異的阻害が確認された。そこで、NICR阻害の脳機能への影響を調べる一環として、先ず、小脳シナプス可塑性について調べた。ノックインマウスの平行線維－プルキンエ細胞シナプスでは、LTPが著しく阻害された。一方、同じ平行線維シナプスにおける別のタイプの可塑性、長期抑圧LTDには、野生型との間に有意な差が見られなかった。したがって、ノックインマウスにおける、小脳LTPの特異的阻害が示された。引き続き、小脳機能への影響を調べるため、先ず、回転棒テストにより運動学習への影響に着手しており、ノックインマウスにおいて運動協調に阻害があることを示唆する予備的結果が得られている。
平成27年度に得られた結果を受け、ノックインマウスの解析については、平成28年度以降は個体レベルでの機能の解析を進める。先ず、回転棒テストによりC3636Aマウスにおける運動協調阻害を示す。そして瞬膜反射条件付けについて、徳島文理大学・岸本泰司博士の協力を得て、解析を行う。ノックインマウスでは平行線維シナプスLTDは正常だが、LTPに阻害が見られたが、小脳LTDが瞬膜反射条件付け学習の記銘過程への関与が示されていること、LTPはLTDをリバースするとの報告があることから、小脳LTPに阻害が見られるノックインマウスでは、瞬膜反射条件付けの消去過程の阻害が予想される。平行して、 酸化シグナルによるNO依存的Ca2+放出の阻害機構の解明も進める。酸化シグナルが、ジスルフィド化修飾の形成を介しS-ニトロシル化を阻害することで生体機能を阻害すること、及び加齢個体では内因性酸化シグナルによるジスルフィド化修飾形成がS-ニトロシル化の阻害を介して老化の原因になることを、以下の実験により示す。① 酸化試薬(過酸化水素等)前処理済みの若齢個体由来の小脳における1型リアノジン受容体(野生型)のNOによるS-ニトロシル化阻害を、SNOビオチンスウィッチアッセイで確認する。② 酸化試薬前処理済みの若齢個体由来小脳スライス標本におけるNO依存的Ca2+放出阻害をイメージング法により確認する。③ 酸化試薬前処理済みの若齢個体由来小脳内の1型リアノジン受容体におけるジスルフィド化修飾増加を、ジスルフィド化修飾を特異的に検出する生化学的手法(SSビオチンスウィッチアッセイ; 還元剤としてジチオスレイトール(DTT)を用いる)により確認する。④ 上記①～③の解析を酸化試薬前処理を行わない老齢個体由来の小脳サンプルでも行い、内因性酸化シグナルによるNO依存的Ca2+放出の阻害機構と老化への関与を明らかにする。
実験で用いるノックインマウスの交配、繁殖が、当初の予想を大きく上回って順調に進んだため、マウスの交配・繁殖・維持に要する消耗品費が大幅に節約できた。また、表現系解析の一部は、連携研究者を始めとする共同研究者への依頼により結果を得ることができたため、懐石に要する消耗品費を大幅に節減できた。移乗の理由により、次年度使用額が生じた。
本研究課題では、平成２８年度以降、老齢マウスを用いた解析を予定していることから、これらマウスの飼育・維持に多額の消耗品費を計画しており、ここに平成２７年度に節約できた分の予算をつぎ込むことで、より多くの老齢マウスの飼育・維持が可能となり、平成２８年度以降の実験が順調に進むようにする。
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日本薬理学雑誌
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