| 研究課題/領域番号 |
15K06788
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
廣野 守俊 同志社大学, 研究開発推進機構, 准教授 (30318836)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 活動電位 / ランビエ絞輪 / イオンチャネル / 小脳 |
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| 研究実績の概要 |
活動電位の迅速な伝播は脳神経の情報処理において不可欠である。有髄神経では活動電位はランビエ絞輪を介する跳躍伝導によって神経終末へ伝わる。また運動協調にかかわる小脳プルキンエ細胞は高頻度に同期発火して小脳核ニューロンの発火パターンを制御するものの、高頻度発火の活動電位が忠実性（fidelity）を維持しながら伝播する機構は不明である。本研究の目的は、ランビエ絞輪に発現するチャネルによる活動電位伝播の制御とその生理学的意義を明らかにすることである。
本年度は小脳プルキンエ細胞軸索の有髄軸索のランビエ絞輪近傍（パラノード）に発現するCa2+依存性カリウムチャネル（BKチャネル）の生理学的意義を検証した。このチャネルが高頻度発火の活動電位伝播に寄与し、小脳核ニューロンへの抑制性シナプス伝達の制御にかかわることを明らかにした（Hirono et al., 2015, J Neurosci）。パラノードにおけるBKチャネルの活性化にはランビエ絞輪付近のCa2+濃度上昇が必要であるが、その供給源は不明である。そこでランビエ絞輪近傍に発現する可能性のあるT型 Ca2+チャネルの寄与について、逆行性活動電位を記録しながら、阻害剤であるニッケルを局所投与すると高頻度刺激下での活動電位の欠失頻度（failure rate）が上昇した。したがって、ニッケル感受性Ca2+チャネルを介して流入したCa2+によってBKチャネルは活性化されることが示唆された。ランビエ絞輪へのグルタミン酸受容体アゴニストあるいはアンタゴニストの局所投与の作用については現在実験を進めているところである。またプルキンエ細胞の高頻度発火は種々の入力により修飾を受けるが、パルス波やステップ波といった脱分極の長さに応じて位相応答性が如何に変化するか詳細には分かっていない。この点について実験データを集め解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで採用してきた逆行性活動電位の記録法では、スライス表面近くの細胞から記録するため軸索が切断されている場合も多く、逆行性活動電位を安定して測定できる確率はあまり高くない。そのため統計的有意差を検討するのに必要なデータ数を増やすために予想以上の時間が掛かっている。しかしコンスタントに実験することにより徐々にデータ数を蓄積することは可能である。次年度は実験回数を増やし、複数の薬物をピコポンプで局所投与することでグルタミン酸受容体のアゴニストやアンタゴニストの作用を評価する予定である。また薬物が局所投与されていることを確認して細胞体付近に投与した場合の電気生理学的応答の相違について検討を行う。
これまでランビエ絞輪とパラノードのマーカーにはNav抗体とCasper抗体をそれぞれ用いてきた。ランビエ絞輪付近に発現するグルタミン酸受容体の免疫組織化学染色法による同定には、より選択的な抗体が求められるが流通している多くの抗体を試すには購入費が掛かるため、その選定が予定通り進んでいない。これまで購入あるいは作製した抗体による染色を軸にして免疫組織化学染色法を展開する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで逆行性活動電位を活動電位伝播の指標としてきたが、より生理的な活動電位を測定するため順行性活動電位をプルキンエ細胞の軸索から軸索パッチにより記録する。プルキンエ細胞の細胞体にホールセルパッチ記録法を用い、蛍光色素を細胞内に注入して軸索を可視化する。可視化されたプルキンエ細胞の軸索にcell-attached記録法を用いて軸索での活動電位を記録する。細胞体に電流注入して脱分極して細胞体での発火パターンと軸索での発火パターンを比較する。グルタミン酸受容体の種々アンタゴニストやアゴニストを局所投与してその効果を検討する。さらに登上線維の刺激によって生じる複雑スパイクについても同様の解析を行う。
毎回プルキンエ細胞の細胞体にホールセルパッチして蛍光色素を注入し、軸索の長さを観察するのは非常に実験効率が悪い。何故なら小脳切片作製中に軸索の多くは切断されてしまうためである。そこでGFPを発現するプルキンエ細胞が散在する小脳サンプルを作製する。野生型マウスの小脳に、MSCVプロモーターでGFPを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを感染させる。力価を調整してプルキンエ細胞がまばらにラベルされる小脳を作製する。この小脳切片中では軸索が切断されていないプルキンエ細胞を容易に同定できると期待される。このマウスを用いて複雑スパイクを含めた順行性の活動電位を記録し、種々薬剤の効果を検証する。
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