| 研究課題/領域番号 |
15K06791
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
濱田 耕造 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (00311358)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | カルシウムチャネル / シグナル伝達 / アロステリック / タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
認知症に有効な治療法は未だ無く新たな分子メカニズムの探索が必要である。本研究では小胞体カルシウムチャネルのアロステリック制御異常が認知症の機能障害や毒性機序に関与するという新しい仮説について研究を行っている。脳の神経細胞に信号が伝わると細胞膜から遊離するIP3が小胞体に局在するIP3受容体に結合しチャネル構造のアロステリック変化を起こす。その際IP3受容体からカルシウムイオン(Ca2+)が放出され記憶や学習に必要な細胞過程を引き起こす。本研究ではこのIP3受容体のアロステリック変化がオートファジーの制御異常に関わることが示唆され、この成果は共著で総説に紹介された(Autophagy, 2016)。更にこれを認知症の予防法や創薬に役立てるにはアロステリック変化の詳細なメカニズムを理解する必要がある。昨年末クライオ電子顕微鏡で解析されたIP3受容体の四量体構造が報告されたが、機能的に重要な調節領域の分解能は低くCαモデルのみで、IP3による構造変化の知見は断片構造に限られており（全体の20%）、アロステリック変化のメカニズムは未解明である。本研究ではアロステリック変化の動作原理を解明するため、全体の80％を占める巨大な細胞質ドメインの負染色やクライオ電子顕微鏡、そしてＸ線結晶構造解析を行い解析可能なサンプル調製法を独自に開発し結晶化の初期条件を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
IP3受容体の動作原理は同じく小胞体Ca2+チャネルであるリアノジン受容体と共通であり、これまで細胞生物学的な手法により四量体サブユニット間の協同的相互作用を介したアロステリック変化の重要性を見出しその機能的な意義を明らかにした。本研究では物理化学的手法によりIP3受容体のアロステリック変化を分析可能な実験系の開発を目指す。バキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系により細胞質ドメインに変異を持つIP3受容体の様々な組み換え蛋白質を作成し大量発現・精製を行った。クライオ電子顕微鏡と負染色によるタンパク質の単粒子観察と動的光散乱測定により溶液中で単分散を示す細胞質ドメインを得た。初期スクリーニングによりこの細胞質ドメインの結晶化条件を見出した。並行してアロステリック変化に重要な部位を同定するため新しい機能解析法を企画し開発した。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでにIP3受容体のアロステリック制御異常がハンチントン病の発症に関与する可能性について実験を行ってきた。今後はこれを発展させるためアルツハイマー病など他の神経変性疾患モデルを用いて独自の仮説を検証する。認知症原因タンパク質とされるタウやハンチンチン、そしてαシヌクリンなどがIP3受容体のアロステリック制御異常を起こすか否か実験する。並行してアロステリック変化の分子メカニズムを解明するため既に得られた結晶化の初期条件及びタンパク質の変異部位を更に精密化しＸ線回折実験を行い構造解析可能な結晶化条件を得たい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の中心となる実験のうち通常業務として行っているものについての予算の執行は概ね計画通りであった。しかし、論文投稿の追加実験が予定通り行えなかったことが主な理由であると考えられる。昨年度中に本研究計画に関連する研究内容を世界的に影響力のある雑誌に投稿したが、出版社から査読コメントが戻るまで時間が経過しその後リジェクトされた。更に、別の雑誌に投稿したが査読コメントが戻るまでに更に予想以上の時間が経過した。これらにより論文の査読コメントを得てから購入する予定であった試薬や消耗品の購入が保留のままとなった。結果として昨年度に購入予定であった試薬や消耗品の購入が次年度に繰り越されたので、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に入り世界的にハイプロファイルな雑誌から査読コメントが届き、リバイズを許された。論文リバイズに必要な試薬と消耗品を購入する必要がありこれについて予算を使用する。査読コメントは３人の査読者よるレベルの高い科学的アドバイスで ありコメントに対して完全に答え論文受理を得るためには、３ヶ月の間に質の高い実験を速やかに行う必要がある。このため時間の節約を優先するための諸経費にも迅速に予算を執行していく予定である。
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