| 研究課題/領域番号 |
15K06802
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
鈴木 賢一 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任准教授 (90363043)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ネッタイツメガエル / ゲノム編集 / ノックアウト / ノックイン |
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| 研究実績の概要 |
逆遺伝学的アプローチが可能なネッタイツメガエルやイベリアトゲイモリは、近年、ヒト疾患メカニズムの解明や創薬開発における実験動物としての価値が高まっている。本申請課題では、これら２種におけるゲノム編集技術を基盤とした遺伝子改変動物作製技術の確立を目的としている。
当該年度（初年度）は、ゲノム編集法を用いた高効率の遺伝子改変（ノックアウト・ノックイン）技術プロトコールを確立するため、様々な実験条件の検討やジェノタイピング法の開発を行った。まず初めに、ネッタイツメガエルにおいて、色素合成に関する遺伝子を標的としたノックアウト実験によりCRISPR-Cas9システムの有効性を検討した。得られた表現型個体をアンプリコンシークエンス解析した結果、F0（当世代）個体において体細胞変異率が９５％以上という、非常に高い遺伝子変異導入効率が得られた。Cas9 mRNAやgRNA合成の最適化、変異導入効率解析法やオフターゲット解析法を検討し、当世代(F0)胚による簡便かつ高効率な遺伝子ノックアウトプロトコールを確立した。次に、ネッタイツメガエルにおけるノックイン技術の開発を行った。様々な条件検討の中で、マイクロホモロジー媒介末端連結(MMEJ)を利用したノックイン法が有効であることが示唆された。そこで、CRISPR-Cas9とドナーベクターをネッタイツメガエル受精卵に導入し、ある変異型疾患遺伝子 cDNAを標的遺伝子のイントロンにMMEJを介してノックインする実験を行った。その結果、標的領域への疾患型遺伝子cDNAのノックインをジェノタイピングにより確認した。これらの個体に関しては性成熟させ、次世代を得る予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ネッタイツメガエルにおけるCRISPR-Cas9を用いたノックイン及びノックアウト実験に関する十分な条件検討を行うことができた。特にノックアウトに関する研究に関しては予想外の成果が得られ、今後、ツメガエル研究コミュニティーに置いて汎用されることが期待される。また、申請者らが開発したMMEJを利用したノックイン法の有効性がネッタイツメガエルでも示され、本申請課題の遂行にもおおよその見通しが立ったと考える。一方、施設や飼育施設の整備の問題でイベリアトゲイモリの導入が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ネッタイツメガエル及びイベリアトゲイモリに、安定して外来遺伝子を導入するためのゲノム部位に関しては候補の目処がついた。時期組織特異的な遺伝子発現システムに関しては、本申請以降に新しい方法が開発されてきたので、これらのストラテジーも検討している。飼育設備の整備を行ったため、イベリアトゲイモリの研究は本格的に開始可能となった。また、ネッタイツメガエルに関しては、NBRPネッタイツメガエルの良質な材料供給を受けながら、引き続き本申請課題を遂行していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一万円以下の少額であったため、次年度に持ち越し合算して使用した方が有効に使用できるため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
少額であるため、次年度に少額消耗品もしくは旅費の一部に使用予定。
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