| 研究課題/領域番号 |
15K06805
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
北村 浩 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (80312403)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ２型糖尿病 / マクロファージ / 糖代謝 / 骨格筋 / 視床下部 / ユビキチン / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
１）Usp2fl/flマウスとLyz-Creマウスを交配して得られたマクロファージ選択的Usp2ノックアウトに１年間にわたり高脂肪餌を与え体重や摂食量、インスリン感受性を評価し、血糖値や血中脂質（コレステロールや中性脂肪、遊離脂肪酸）などの血液指標も調べた。しかしながらUsp2ノックアウトマウスに明確な表現型の変化は認められなかった。従って、軽微な抗糖尿病効果が認められたマクロファージ選択的Usp2トランスジェニックマウスと異なり、２型糖尿病や肥満症に対してマクロファージでのUsp2の欠損は影響を与えないことが判明した。恐らく何らかの代償効果が働いたと考えられる。
２）低血糖マウスと通常マウスの間脳視床下部を材料にオリゴプローブを用いたin situ ハイブリダイゼーションを実施し、Usp2の発現細胞を調べた。弓状核、室傍核など摂食調節や自律神経活動の制御中枢のニューロンにおいてUsp2の顕著な発現が認められた。in situ ハイブリダイゼーションでは低血糖による明確なUsp2の発現変化は認めらなかったが、定量性の高いqRT-PCR法では視床下部での発現変化が認められた。
３）低血糖状態にすると、マウスの骨格筋及び培養株化骨格筋細胞でUSP2の発現が大きく変化した。CRISPR/Cas9システムを用いて作成したUsp2欠損マウス筋肉細胞及び脂肪細胞において、複数の糖代謝関連遺伝子の発現が影響を受けていた。
４）USP2強制発現細胞（線維芽細胞）を用いて核内においてUSP2と結合するタンパク質を複数見出した。またマクロファージで解析するためのタグ付きUSP2を発現するウイルスベクターを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マクロファージ選択的なUsp2ノックアウトマウスの解析は予定通り実施できた。骨格筋及び脂肪細胞選択的Usp2ノックアウトマウスは作成に至らなかったが、代わりにCRISPR/Cas9を用いて作成した培養筋肉細胞及び脂肪細胞を用いて、細胞レベルでの機能解析を先行させることができた。USP2の標的分子の同定についても結合分子を安定的に検出し、さらに遺伝子発現制御効果が明確なマクロファージを用いた検討のためのツールも整備できた。さらに脳のin situ ハイブリダイゼーションにおいて、視床下部でUSP2を発現する細胞の同定に至った。以上より、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）USP2ノックアウト細胞で見出された遺伝子発現変化と糖代謝機能との関係を培養細胞を用いて検討を進めると共に、その発現制御について解析を進める。
２）骨格筋選択的、脂肪細胞選択的なUSP2ノックアウトマウスの作成を進める。またこれらマウスが樹立できれば、表現型解析を進め、骨格筋では糖代謝の制御能や骨格筋の構造変化を調べ、白色脂肪細胞では脂肪代謝や糖の取り込み、アディポサイトカインの産生能の変化を調べる。
３）線維芽細胞ならびにマクロファージの核においてUSP2と結合するタンパク質を質量分析で調べる。またUSP2がヒストンのアクセシビリティを制御するという知見を得ていることから、ヒストン制御分子のユビキチン化状態に対するUSP2の役割を調べる。
４）USP2を発現するニューロン選択的なUSP2ノックアウト（ノックダウン）モデルを作出し、行動や糖代謝に対する効果を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初申請していた金額から減額されたことから、高感度化学発光撮影装置（約140万）の購入をウエスタンブロットの使用頻度が高い翌年以後に繰り越した。また骨格筋および脂肪細胞選択的ノックアウトマウスがまだ樹立されていないので、それらの飼育経費を繰り越すこととなった（約20万）。qPCR用試薬やプラスチック消耗品が予想以上必要であったのに対し、タンパク精製用の脱塩・濃縮チップや抗体類を本年は予定以上に購入しなかったことや、関連研究についての他の外部獲得資金の使用で賄えたので次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初の予定通り、ノックアウトマウス作製のためのCreマウスの購入やqPCR用試薬、タンパク精製試薬に翌年度分として請求した助成金は使用する。加えて、繰越金についてはマウスの維持やタンパク精製試薬、高脂肪餌などの試料の購入に充てたい。
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