| 研究課題/領域番号 |
15K06807
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
吉田 哲 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (00365438)
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| 研究分担者 |
三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10270901)
汲田 和歌子 公益財団法人実験動物中央研究所, その他部局等, 研究員 (50549128)
徳永 暁憲 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, その他部局等, その他 (70549451)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | マーモセット / ノックイン / CRISPR |
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| 研究実績の概要 |
これまで生物学の分野、特に脳神経系機能を解析において、モデル動物としてマウスがしばしば用いられてきた。これは、マウスの身体が小さく飼育に適している、子をたくさん産むなど、モデル動物として適する条件を持っていること、また、遺伝子改変が容易に行なえることが理由としてあげられる。近年、ヒトと近縁であることからマーモセットなど非ヒト霊長類動物の解析がさかんに行なわれてきている。マーモセットは、マウス同様モデル動物に適した特性を持つが、これらのES/iPS細胞はnaive状態ではなくprimed状態であるため、マウスのようにES細胞を用いた遺伝子改変はできない。そのため、マーモセットにおいて遺伝子のノックインおよびノックアウトを行う場合、受精卵のゲノムに改変を行なう必要がある。しかしながら、マーモセットは、受精卵がマウスほどとれない上、遺伝子改変が行なわれていなくても処分することができない。よって、遺伝子改変を行なう際、組換え効率が問題となる。
そこで、本研究では、ノックインベクターがゲノムに組換える効率を高める技術開発を行う。まず、マーモセットの受精卵で遺伝子ノックインを行なうためのドナーDNAおよびノックインする遺伝子座のゲノムを切断するCRISPR/Cas9の作製を行なう。さらに、これらをマーモセット受精卵に導入した際に、遺伝子が効率よくノックインされるようにするための薬剤や遺伝子などの探索を行なう。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子ノックイン・マーモセットを作製するために、３種類のドナーDNAを作製した。また、それぞれの遺伝子座を標的とするCRISPRを３種類ずつ作製した。それぞれの活性は、サロゲートベクターを作製して確認した。サロゲートベクターとは、同一のプロモーター調節下に、赤色蛍光タンパク質(DsRed)と緑色蛍光タンパク質(GFP)が、CRISPRの標的配列を挟んでコードされており、そのままだとフレームがそろっていないのでDsRedしか発現しないが、CRISPRにより標的配列が切断され、そこに変異が入った場合のみGFPも発現する仕組みになっている。すなわち、サロゲートベクターとCRISPRを同一細胞にトランスフェクションし、そのCRISPRが標的配列を切断した場合（すなわちそのCRISPRに活性があった場合）GFPが発現する。
このほかに、同じ遺伝子座について、ヒトとマウスについてもドナーDNAとCRISPRの作製を行った。これらを用いて、遺伝子組換えが効率よく行なわれるようにするための薬剤や遺伝子などの探索を行なう予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、受精卵にインジェクションする予定であるドナーDNAにネオマイシン耐性遺伝子を導入した後、このドナーDNAをCRISPRとともにマーモセットES細胞に導入し、組換えがおこることを確認する。同様の実験を、ヒトおよびマウスのドナーDNAおよびCRISPRを用いて行う。細胞は、それぞれ、ヒトiPS細胞およびマウスES細胞を用いる予定である。
次に、組換えを更新させる方法を、マウスES細胞およびヒトiPS細胞を用いて探索する。ヘルパー依存型アデノウイルスベクターが感染することにより、組換え効率が良くなることが報告されている(Suzuki et al., PNAS, 2004)ので、まずこれについて試す予定である。また、組換えを更新させる遺伝子や薬剤についても探索する予定である。
さらに、マウスの受精卵にドナーDNAおよびCRISPRを導入し、マーモセット受精卵で組換えをおこす予備実験を行う。この時、上記実験にて発見された組換えを更新する方法が、ES細胞やiPS細胞だけでなく受精卵でも同様の働きをするかどうかを確かめる。
マウス受精卵で効率良く組換えが行われることが証明されたら、マーモセット受精卵でも同様の実験を行い、遺伝子ノックイン・マーモセットを作製する。
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