| 研究課題/領域番号 |
15K06811
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
大倉 定之 日本医科大学, 医学部, 助教 (10731036)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ウイルス / ヒト化マウス / 造血幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト正常妊婦から提供を受けた臍帯血から造血幹細胞を、また臍帯から間葉系幹細胞を分離、精製し、培養にて増殖させた。間葉系幹細胞はsphereとして3次元培養し、造血幹細胞と共培養することによって間葉系幹細胞と造血幹細胞を相互作用させた。このsphereまたは造血幹細胞のみをコンディショニングした免疫不全マウスに移植することにより、免疫系をヒト化したマウスの作製が可能になった。
間葉系幹細胞は免疫制御の効果が報告されているが、本研究で間葉系幹細胞・造血幹細胞のsphereを移植したマウスは、造血幹細胞のみを移植したマウスと比較して、ヒト由来の免疫系再構築の効率が著しく低下した。この結果から、同時に移植した間葉系幹細胞が造血幹細胞からの免疫担当細胞の分化に何らかの影響を及ぼした可能性が考えられた。
ヒト由来免疫系が再構築されたマウスにHIV-1をベースとしたGFP・Luciferase遺伝子をコードするデュアルレポーターレンチウイルスを感染させ、感染実験の条件決めを進めている。メスマウスを経膣感染、オスマウスを経直腸感染させ、感染数時間後に感染臓器を摘出、Luciferin溶液に浸漬し、IVISシステムを用いて化学発光の検出を試みた。IVISシステムの検出感度の問題から現時点でウイルス粒子の発光シグナルは検出できていないが、検出を可能にするべく条件決めを実施している。感染臓器はホルムアルデヒド固定後凍結切片を作製し、蛍光免疫染色を行った。その結果ウイルス粒子と考えられる蛍光シグナルが認められた。現在、感染部位に存在する免疫細胞の同定を進めている。
以上の結果から、経粘膜感染後のウイルス動態を解析する小動物実験系が確立し、今後感染直後に感染の標的となる細胞および感染により誘導される免疫細胞を解析できると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
動物実験管理区域の汚染もあり、計画の進捗状況はやや遅れていたものの、作製したヒト化マウスにウイルス感染させる段階まで計画を進めることができた。IVISシステムによるウイルス粒子の発光シグナルの検出は感度の問題から現時点では実現できていないが、蛍光免疫染色による感染臓器切片の解析ではウイルス特異的と考えられる蛍光シグナルが観察された。こうした結果から、計画していた感染実験をおおむね遂行できていると考えている。ただ免疫染色では染色のバックグラウンドが比較的高く、シグナル検出のため条件決めが必要である。
以上の理由により、おおむね順調に進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
造血幹細胞単独移植群ではヒト免疫担当細胞の再構築率が高かったことから、当面は同移植群を感染実験に使用する。間葉系幹細胞・造血幹細胞の共移植群では、ヒト由来免疫担当細胞の再構築効率を改善するため、造血に関与するヒトサイトカイン遺伝子を間葉系幹細胞に導入する。この遺伝子発現間葉系幹細胞を造血幹細胞と共培養して3次元培養し、形成されたsphereを移植することによって再構築効率の改善を試みる。
IVISシステムを使用したLuciferase分子の発光検出では、検出感度の問題からウイルス粒子を検出できない可能性がある。このため、免疫染色時にウイルス粒子に由来する蛍光シグナルの増強を試みることで、蛍光免疫染色におけるウイルス粒子の検出効率を上げるよう、条件設定を行う。
HIV-1ベクターを用いた感染実験は開始しているので、感染部位に集積する免疫担当細胞の解析を進めるとともに、感染後経時的に感染臓器を摘出し、ウイルス粒子の検出・免疫細胞の種類にどのような経時的変化が生じるのか解析を進める。同時に他のウイルスを用いた感染実験を開始し、HIV-1感染実験と同様に、ウイルス粒子周辺に集積した免疫担当細胞の解析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「次年度使用額が生じた理由」
2017年度最終月までに、ヒト化マウスに実際にベクターウイルスを感染させる段階まで研究が進み、感染直後のウイルス感染の動態と近傍に局在する免疫細胞の解析を開始した。学術論文としてまとめるデータを得るために感染実験系の最適化を行った上で、再現性の確認および経時的な感染実験が必要である。これに係る実験のために、本助成金の次年度使用額を充当する予定である。
「使用計画」
次年度使用額は、（１）感染局所周辺に局在する免疫担当細胞を検出・同定する目的で、CD特異的抗体を追加購入する費用、（２）接種ウイルスの感染効率を上げるためにヒト化マウスに処置する化合物の購入費用、および（３）免疫染色に関連する試薬・消耗品を購入する費用に使用する予定である。
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