| 研究課題/領域番号 |
15K06820
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
堀江 香代 弘前大学, 保健学研究科, 助教 (30626825)
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| 研究分担者 |
渡邉 純 弘前大学, 保健学研究科, 教授 (10201188)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 卵巣癌 / エクソソーム / miRNA / micro array |
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| 研究実績の概要 |
漿液性嚢胞腺癌(HRA)、類内膜腺癌(TOV112D)、粘液性嚢胞腺癌(MCAS)、明細胞腺癌(HAC-2)およびヒト卵巣表面上皮細胞(HOSE)の培養上清からエクソソームを回収するにあたり、3種のキットを用いて回収率や操作の簡便性について検討を行った。回収したエクソソームはエクソソームタンパク質マーカーCD63によるウエスタンブロットおよびナノサイトによる粒子経や濃度の測定による評価を行いエクソソームが回収されていることを確認した。さらに回収したエクソソームからmicro RNA抽出法の検討を行い、既存のキット試薬を変更した方法を用いることで効率よくmiRNAを抽出する方法を確立した。抽出したmiRNAはバイオアナライザにより量・質のチェックを行った結果、small RNA領域にピークを認めた。以上の方法を用いて回収された4種の卵巣癌細胞株エクソソーム由来miRNAとコントロールとして卵巣表面上皮細胞エクソソーム由来miRNAについてマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子解析を行った。加えて細胞抽出液についても同様にmiRNA解析を行った。その結果、正常卵巣上皮細胞に比べ４種の卵巣癌で共通して発現の増加が認められたエクソソーム内在miRNA 1種、発現の低下が認められたmiRNA 99種を検出した。また細胞内で発現が増加していたmiRNA 22種 発現の低下が認められたmiRNA16種を検出した。そのうちエクソソームと細胞内で共通して発現の低下を認めたmiRNAは14種であった。一方、共通して発現の増加を示したmiRNAは認められなかった。本年度の成果として卵巣癌培養細胞上清からのエクソソーム内在miRNA解析方法を確立し、異なる組織型の卵巣癌細胞株のエクソソーム内在miRNAと細胞内miRNAのプロファイルを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「卵巣癌エクソソーム内在候補miRNAの検出を中心に行う」という平成27年度の計画はおおむね順調に進んでいる。計画では使用する卵巣癌培養細胞は漿液性嚢胞腺癌(HRA)1種で行う予定であったが、組織型の異なる卵巣がん細胞株類内膜腺癌(TOV112D)、粘液性嚢胞腺癌(MCAS)、明細胞腺癌(HAC-2)およびヒト卵巣表面上皮細胞(HOSE)の培養上清を用いエクソソームを回収することとした。この結果から癌細胞で共通して発現するmiRNAや組織型によるmiRNA発現の違いなど詳細な卵巣癌エクソソーム内在miRNAプロファイルが得られることが期待される。またエクソソームの回収法については現在、複数の会社から原理の異なる様々なキットが発売されているが、回収効率等の詳細は不明であった。現在までに3種のキットを検討し、最も効率よくエクソソームを回収する方法を確立した。この方法を用いて、培養細胞から安定してintactなエクソソームの回収が可能となった。またエクソソーム内在miRNAの抽出についても複数のキットを検討し、試薬濃度等キットの最適化を行った。今後はintactなエクソソームの回収がコンスタントに行われることでmiRNAのみでなくタンパクやmRNAを含む詳細なエクソソーム解析が可能になると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．現在までに検出された正常卵巣上皮細胞に比べ４種の卵巣癌で共通して発現の増加が認められたエクソソーム内在miRNA 1種、発現の低下が認められたmiRNA 99種についてMir-X miRNA qRT-PCR SYBR® Kitとアプライドバイオシステム社の定量PCR装置StepOne Plusを用い、培養上清及びHRA細胞内のmiRNA発現量を測定する。
２．発現が低下していたmiRNAは 腫瘍増殖抑制に関わる可能性が考えられるため、HRA細胞培養上清より抽出したエクソソームに候補miRNAをExo-Fect Exosome Transfection Kitを用いて過剰導入する。
３．同様に発現が増加していたmiRNAは腫瘍増殖や浸潤に関わる可能性が考えられるため、microRNA Inhibitorを用いてエクソソーム内の候補miRNAを抑制する。
以上の工程より腫瘍抑制型エクソソームを作成し以後の実験で、その効果を検証する。
４．加えて候補miRNAのターゲットとなるmRNAについてTrget scan等のデータベースを用いた解析行う。作成した腫瘍抑制型エクソソームを作用させて場合の細胞内mRNAを回収し同様にリアルタイムPCRを用いてターゲットmiRNAとmiRNAの関係を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エクソソーム回収キットが当初計画よりも安く入手できた。
またmiRNA抽出の検討が予定よりも早く進んだため使用する試薬が計画より少量で済んだ。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の差額は次年度のエクソソーム内在miRNAのリアルタイムＰＣＲや詳細な機能解析のために使用する。
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