| 研究課題/領域番号 |
15K06820
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
堀江 香代 弘前大学, 保健学研究科, 助教 (30626825)
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| 研究分担者 |
渡邉 純 弘前大学, 保健学研究科, 教授 (10201188)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 卵巣癌 / エクソソーム / miRNA |
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| 研究実績の概要 |
前年度までに、漿液性嚢胞腺癌(HRA)、類内膜腺癌(TOV112D)、粘液性嚢胞腺癌(MCAS)、明細胞腺癌(HAC-2)およびヒト卵巣表面上皮細胞(HOSE) を用い細胞培養上清からのエクソソーム内在miRNA解析方法を確立し、異なる組織型の卵巣癌細胞株のエクソソーム内在miRNAと細胞内miRNAのプロファイルを明らかにした。エクソソーム内在miRNAの報告が少ないことより今後はエクソソーム内在miRNAに焦点を絞り研究を進めることとした。本年度は新たな卵巣癌培養細胞株を加え、エクソソーム内在miRNAマイクロアレイ解析を行い、卵巣癌細胞株エクソソームで共通して高発現を示した候補miRNA3種を検出した。また、卵巣癌において発現の低下が報告されているmiRNA であるLet-7やmiR-127のエクソソーム内在miRNA発現は概ね減少の傾向を認めたが、明細胞腺癌(HAC-2)は変わらないか増加を示し、他の３種の組織型と異なる発現プロファイルを示すことを確認した。さらに候補miRNAについてデータベース（Trget scan）を用いたターゲットmRNAの予測やKEGGによる遺伝子パスウェイ解析を行った。加えてエクソソーム内在miRNAのリアルタイムPCRの条件を確立し、マイクロアレイで検出した候補miRNAの定量化を行った。本年度の成果としてエクソソーム内在miRNA発現量測定に用いるリアルタイムPCR用の内因性コントロールを確立した。その方法を用いて組織型の異なる卵巣癌細胞株で共通して高発現を示したエクソソーム内在miRNAの定量化を行い、その発現量を比較した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成２８年度の計画はやや遅れている。その理由として前年度のマイクロアレイ結果の再現性の確認やエクソソーム内在miRNAのリアルタイムPCRの条件検討に時間がかかったことが挙げられる。前年度に行ったマイクロアレイ解析の結果では明細胞腺癌(HAC-2)は他の組織型とはかなり異なる発現プロファイルを示した。この結果の再現性を確認するために再度５種類の細胞株からエクソソーム内在miRNAを抽出しマイクロアレイ解析を行った。加えて明細胞腺癌や類内膜腺癌、漿液性嚢胞腺癌の細胞株を新たに購入し解析に加えた。また今回用いたmiRNA micro arrayは前回よりバージョンが上がり２培近いmiRNAの検出が可能となった。これらの結果においてもHAC-2は前回と同様、他の組織型と異なるプロファイルを示すことを確認した。高発現を示したmiRNAについてアプライドバイオシステム社のTaqMan Small RNA Assays試薬と定量PCR装置StepOne Plusを用いエクソソーム内在miRNA発現量の測定を行った。エクソソームでは特定の内在性コントロールが確立しておらず、まずは内在性コントロールの検討を行った。エクソソーム内にもmRNAが存在することからcell Lysateで使用されるβアクチンやGAPDHの定量を行った。その結果、細胞間で最大３倍程度の差が認められ内在性コントロールとしてはばらつきが大きいと思われた。次にsmall RNAであるU6を用いた定量結果では、細胞間での最大差は1.3倍であり、各細胞間のばらつきも少なく内在性コントロールとして使用可能なことを確認した。このコントロールを用いて候補因子の１つであるmiR24の定量化を行った。その結果マイクロアレイとは異なる結果を示した。今後、他の因子についても解析を進めていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．現在までに検出された正常卵巣上皮細胞に比べ卵巣癌で共通して発現の増加が認められたエクソソーム内在miRNAについてアプライドバイオシステム社のTaqMan Small RNA Assays試薬と定量PCR装置StepOne Plusを用い、エクソソーム内在miRNA発現量を測定しマイクロアレイの結果を確認する。
２．発現が低下していたmiRNAは腫瘍増殖抑制に関わる可能性が考えられるため、HRA細胞培養上清より抽出したエクソソームに候補miRNAをExo-Fect Exosome Transfection Kitを用いて過剰導入する。
３．同様に発現が増加していたmiRNAは腫瘍増殖や浸潤に関わる可能性が考えられるため、microRNA Inhibitorを用いてエクソソーム内の候補miRNAを抑制する。
以上の工程より腫瘍抑制型エクソソームを作成し以後の実験で、その効果を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
miRNAリアルタイムPCRの検討に時間がかかり、本年度予定であった「候補miRNAを過剰導入・抑制した腫瘍抑制型エクソソームの作成」に着手できず、遺伝子導入や遺伝子抑制に関する試薬を購入しなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の差額は次年度に行う「候補miRNAを過剰導入・抑制した腫瘍抑制型エクソソームの作成」のために使用する。
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