| 研究課題/領域番号 |
15K06885
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
吉田 徳之 立命館大学, 薬学部, 助教 (10363996)
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| 研究分担者 |
木村 富紀 立命館大学, 薬学部, 教授 (40186325)
杉江 知治 関西医科大学, 医学部, 教授 (70335264)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 非コード性RNA / 乳癌 / 核酸医薬 |
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| 研究実績の概要 |
1. ヒトEphA2アンチセンス（AS）RNAのノーザンブロッティング：EphA2 AS RNAはポリA鎖を有し、全長1.9 kb長及び5 kb長と推定され、前者が大部分であることが示された。
2. 5’RACE及び3’RACE：ポリA鎖を除くと、全長990 b長及び1282 b長の3’端が異なる2種類のEphA2 AS RNAが存在することが示唆された。また、1282 b長のEphA2 AS RNAは、同mRNAとは異なるスプライシングを有していた。EphA2 AS RNAの5’端は、同mRNA 3’UTR中の3589番目の塩基に位置した。この結果をRT-PCR法により検証したところ、3881番目の塩基まで増幅可能であったので、この差異は発現頻度が低い5 kb長EphA2 AS RNAの5’端に由来すると考えられた。
3. 細胞遊走アッセイ系におけるヒトEphA2 AS RNA発現抑制：申請時点で確認していたEphA2 AS RNA発現を抑制するオリゴ（seODN）は、その発現を45%まで抑制した。しかしながら、上記EphA2 AS RNAの同定結果から、このseODNは少数（低発現）のEphA2 AS RNAに対するものであると考えられた。そこで、同定した大部分のEphA2 AS RNAに対し、その発現を抑制するseODNを再設計した。その結果、EphA2 AS RNAの発現を20%まで抑制する効率のよいseODNが得られた。現在、この効果の再現性を検討している。
4. ヒト乳癌患者由来の癌組織を用いたEphA2 mRNA及び同AS RNA発現解析：臨床検体19症例を解析し、EphA2 AS RNAと同mRNAには正の相関関係が認められた。
以上の結果から、臨床検体でEphA2 AS RNAと同mRNA間における正の相関関係を確認し、ヒトEphA2 AS RNAを同定し、その発現を抑制するより効率のよい核酸シーズとなりうるseODNを設計した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトEphA2 AS RNAに関して、臨床検体における発現、培養細胞を用いた同定と機能解析を計画し、「研究実績の概要」に示した4項目を行った。これらの中で追加実験が生じたのは、機能解析に関する1項目となる。これは、ヒトEphA2 AS RNAの同定結果から、申請時点で確認していたヒトEphA2 AS RNAの発現を抑制するseODNより更に効果のよいseODNが予想されたために、seODN再設計及びその効果検討実験を行ったことに起因する。その結果、培養細胞におけるseODNを用いたEphA2 AS RNAの機能解析が遅れた。しかしながら、これは実験をステップバイステップで進め、少しずつ軌道修正をしながら研究を進捗させていく論理的思考の結果である。さらに、今回の軌道修正は、標的の発現を抑制するseODNという核酸医薬シーズの核となるものであり、より効果の高く質の良い創薬シーズになることの期待が高いと考えられる。
臨床検体の解析に関しては、当初の予定である設定臨床数20症例にほぼ達することができ、ヒトEphA2 AS RNAと同mRNA間における正の相関関係を確認することができた。しかしながら、乳癌のサブタイプに分類して検討したところ、実験群によっては症例数が統計解析するには不十分であることがわかった。そのため、解析症例数を増やして、臨床研究を継続する予定である。検体の臨床データに関しては、未知の状態、かつ無作為に行っているため、これは不可避の結果である。臨床研究の症例数を増やすことに関しては、軽微な変更であるために、所属機関の倫理委員会において迅速審査で対応可能であるため、速やかに検体の採取、解析と進むことができると考えられる。
以上のことから、おおむね順調に研究計画が遂行されていると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトEphA2 AS RNAの発現を抑制する新規seODNの機能解析を培養細胞で速やかに行う。その後、申請書に従い、次の1～4を行う。
1. ヒトEphA AS RNAを標的とするmiRNAをmiRDB、Targetscan、miRWalk、RNA22、RNA hybridなどのmiRNA標的検索ウェブサイトを用いて検索する。
2. The Cancer Genome Atlas (TCGA) やThe MD Anderson Cancer Center (MDACC)などの公開データベースを用いて、予後のよい乳癌患者において発現が増加するmiRNAを探索し、上記1で検索したmiRNAを絞り込む。
3. 上記1と2で探索して絞り込んだmiRNAに関して、ヒトEphA2 AS RNAとの相互作用をルシフェラーゼレポーターアッセイ法によって検証する。
4. 上記3で検証したmiRNAのヒトEphA2 AS RNA以外の標的及び関与するネットワークを調べるために、miRNA発現抑制実験系と強制発現実験系において、RNA Seqを用いてトランスクリプトーム解析を行う。
以上のことから、ヒトEphA2 AS RNAと協働して働き、同mRNAの発現を抑制するmiRNAを検索して、検証することを目的としている。このことによって、ヒトEphA2 AS RNAとmiRNAの相乗効果により、ヒトEphA2 mRNAの発現を効率よく抑制する核酸医薬のコンビネーションを確立する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所要額の内、8%が未使用になった。これは、「研究実績の概要」3における研究計画の軌道修正に起因すると考えられる。具体的には、細胞遊走アッセイに用いるトランスウェルなどの消耗品の未購入のために次年度使用額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額に関しては、当該年度にできなかったヒトEphA2 AS RNAの機能解析実験（細胞遊走アッセイ）における消耗品に使用する予定である。
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