研究課題
家族性の精神遅滞の脆弱X症候群（FXS）は、責任遺伝子FMR1遺伝子の5’非翻訳領域に存在するCGGリピートが母性伝播に際して不安定化して伸長し、FMR1プロモーターとCGGリピート領域の高度メチル化と、それに続くFMR1の発現抑制という一連のクロマチンの変化が起きて発症する。本研究では、このFXSの根本的病因であるCGGリピートの不安定化に伴うクロマチン動態を解明するために、ゲノム編集と染色体操作技術を活用した下記の２つのアプローチによって、CGGリピートに結合して、FMR1遺伝子発現とCGGリピートの動態制御、ひいてはFXSの発症に関わる因子の同定を試みる。１）FMR1遺伝子の発現は、CGGリピート長と逆相関する形で、正常に比べて保因者（不安定化の前段階）で高く、発症すると抑制される。本研究では、FMR1遺伝子のプロモーター直下に蛍光レポーターを導入し、FMR1遺伝子の発現動態を蛍光でモニターできる系を構築する。２）我々は、人工染色体を用いた、任意のゲノム領域に結合する因子を網羅的に回収し、同定する染色体免疫沈降法（以下、ChrIP）という独自のオミクスアプローチの開発をすすめている。ChrIPについては、保因者由来のCGGリピートを人工的に複数個挿入した人工染色体を活用し、保因者のCGGリピートに普遍的に結合しうる因子の同定を試みる。H28年度は１）において、レポーターの発現がCGGリピート長とFMR1発現の相関を反映しなかったため、アプローチ２）を拡充することとした。２）について、ChrIP法のための免疫沈降タグとしてのCRISPR/dCas9系の利用の検討を行った。
3: やや遅れている
H28年度の課題は、CGGリピートの動態を蛍光レポーター遺伝子の発現強度によって評価できる細胞株を樹立することであった。ヒト正常、保因者、並びに患者由来の完全長ヒトX染色体を保持するマウスA9細胞内で、ヒトX染色体上のFMR1遺伝子プロモーター直下への蛍光レポーター遺伝子のノックインを試みた。保因者由来アレルに対してはノックインができなかった。正常アレル及び患者アレルにおいては、ノックイン後の蛍光の発現が非常に弱く、FMR1プロモーター発現の評価が難しいクローンが多く得られた。さらに、患者アレルでのノックインでは、抑制されているはずのFMR1プロモーターが発現している結果となり、以上のことから、アプローチ１）は中止とした。アプローチ２）のChrIPによる因子同定について、タグエピトープ及び蛍光タンパク質を融合したCas9（D10A nickaseまたはdCas9）タンパク質を人工染色体上に集積させ、免疫沈降のタグとして利用するための条件検討を行った。集積させる領域として、人工染色体のヒト２１番セントロメア配列もしくは、CGGリピートを選定し、これらの配列に対するgRNAと組み合わせて一過性に発現させた。人工染色体上へのCas9タンパク質の集積は、蛍光タンパク質の核内でのスポット様の観察を持って評価したが、蛍光顕微鏡下で判断できるほど顕著な集積は認められなかった。
アプローチ１）のFMR1発現のレポーター細胞の樹立は発現のコントロールができないため中止することとし、アプローチ２）のChrIPの方を進める。タグシステムとしてのCRISPR/dCas9系については、集積のさらなる改善が必要であると考えられる。今後はタグシステムそのものの見直しも検討しながら、最適なChrIP条件を探る。すでに資材として完成しているCGGリピートを複数ユニット挿入した人工染色体でChrIPを行い、CGGリピートに結合する因子の同定を進める。その一方で、CGGリピートだけでなく、染色体脆弱部位は染色体領域として取り扱うことが重要であり、CGGリピート不安定化の動態を見るために、またそこで機能する因子を同定するためにCGGリピートを含めた脆弱部位全体を人工染色体に搭載する系も進める。
次年度使用額だけでは、新しく実験に使用する用途がなかったため。
ChrIP（アプローチ２）を進める。また、脆弱部位の人工染色体への搭載も進め、CGGリピートのみ（構築済み資材）、脆弱部位全体の両方でのChrIPの資材を作製していく。
すべて 2017 2016
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (13件) (うち国際学会 5件)
Viral Immunol
巻: 30 ページ: 240, 249
10.1089/vim.2016.0179
Drug Res (Stuttg)
巻: 66 ページ: 126, 129
10.1055/s-0035-1555772
Yonago Acta medica
巻: 59 ページ: 126, 134
Molecules
巻: 21 ページ: -
10.3390/molecules21050663
