| 研究課題/領域番号 |
15K06898
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
佐野 訓明 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (00294405)
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| 研究期間 (年度) |
2015-10-21 – 2019-03-31
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| キーワード | DNAトポイソメラーゼ / 核小体移行シグナル / 機能性RNA分子 / DNA弛緩活性 / 神経関連遺伝子 / 遺伝子砂漠 |
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| 研究実績の概要 |
DNAトポイソメラーゼIIβ（トポIIβ）は、神経細胞の最終分化過程に於いて一群の神経関連遺伝子の発現誘導に必須な核内因子である。トポIIβによって発現が誘導される遺伝子には、数百kbを超える長大な遺伝子が有意に多く含まれている。また、これらの遺伝子は、ジャンクDNAで占められている遺伝子砂漠に隣接する傾向がある。我々は、このような領域に存在する遺伝子の発現誘導にはトポIIβが必要な場合が多いことを明らかにした。
本研究課題では、トポIIβによる遺伝子砂漠近傍の長大な遺伝子の発現誘導を制御している複数の機能性RNA分子の同定を進めるとともに、これらの制御機構の分子メカニズムの解明を目指している。これまで、トポIIβのDNA弛緩活性を抑制して核小体への偏在化に関わるCRD（C末端制御ドメイン）の機能解析を行ってきた。CRDに存在するリジン残基１３個とアルギニン残基３個を４つの領域に区分して、それぞれをアラニン残基に置換した変異型トポIIβ-EGFP融合タンパク質を用いた実験から、CRDの両端にあるリジン残基をそれぞれ置換すると核小体移行が部分的に阻害されることが明らかになった。そして、これらの複数の置換を組み合わせることで、核小体移行が完全に阻害された。しかし、CRDに存在するプロリン指向性セリン/スレオニンキナーゼの認識配列の変異体は核小体局在には影響しなかった。トポIIβの発現タンパク質やCRDを含んだ部分断片にRNAが結合することが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究課題の最も重要な実験計画である“トポIIβのCRDに特異的に結合するRNA分子の同定”が完了しておらず、“遅れている”と判断した。トポIIβを発現精製する過程で結合しているRNAが同時に精製されるが、それが特異的に結合しているかを明らかにすることが難航している。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRDに結合する機能性RNA分子の結合が特異的であることを示すために、発現タンパク質を用いた再構成実験だけではなく、発現細胞からの精製などでも同一分子が精製されてくることを示す。また、野生型CRDに結合するRNA分子を精製するだけではなく、核小体局在に影響がでたリジン置換変異型CRDをネガティブコントロールとして用いて、その結合が特異的であることを証明する。これらのRNA分子が結合することで、局在や活性に影響が出ることを可能な限り示す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画していたRNAの同定が成功していない為に研究の実施が予定より遅れている。RNAの同定以降に実施予定の実験が進んでおらずそのために購入予定の試薬等の物品費が未使用のままである。また、予定していた学会での参加発表が出来なかった為に旅費が未使用である。
結合RNA分子の同定を行うために、実験計画を変更して、細胞からの直接精製だけでなく発現タンパク質による結合実験を組み合わせることで実施を試みる。
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