インスリン遺伝子特異的なエピジェネティック制御に基づく膵β細胞障害の定量法の確立

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K06910
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 黒田 暁生 徳島大学, 先端酵素学研究所(糖尿病), 准教授 (70571412)
• 研究分担者: 松久 宗英 徳島大学, 先端酵素学研究所(糖尿病), 教授 (60362737) ; 田蒔 基行 徳島大学, 先端酵素学研究所(糖尿病), 徳島大学専門研究員 (60624400)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 膵β細胞 / インスリン遺伝子 / 1型糖尿病 / DNAメチレーション / ARMS PCR

研究実績の概要

1型糖尿病は膵β細胞が破壊されることにより血糖降下作用を有するホルモンであるインスリンを分泌できなくなり高血糖を呈する疾患である。1型糖尿病予知因子が陽性な症例や膵臓移植、膵島移植症例で採血を行い、循環血漿中のDNAを単離する。膵β細胞の傷害を受けていない場合には膵β細胞以外の細胞は制限酵素であるMcrBCで切断されるのでその両側にプライマー設定したPCRでは検出することが不可能である。一方で1型糖尿病発症時や、膵移植あるいは膵島移植で拒絶反応が起こり膵β細胞が傷害を受ける場合には膵β細胞を検出できることが想定された。
研究を続けた結果、McrBCではβ細胞以外のすべての細胞由来のDNAを切断することができず、以後3種類の制限酵素を同時に用いた検討も行ったが同様な理由により方法を変更した。以前に試みたDNAにbisulfite処理を行って膵β細胞特異的な配列を認識して増幅する方法に変更した。端的にはプライマーの配列に工夫を凝らしたPCRを2回行うことで106コピーの膵β細胞以外の細胞由来のDNAの中から1コピーの膵β細胞を定量的に検出するPCRの実験系を樹立した。
臨床的には本法を用いて循環血液中から膵β細胞由来のDNA が1型糖尿病患者で23/53例、2型糖尿病患者6/8例、健常人8/13例で検出され、実際にDNA配列は膵臓β細胞由来のものと一致することを確認した。臨床的検査結果とその定量的な検出に関連は見いだせなかったが、発症直後の1型糖尿病患者で1例異常高値を呈する検体を認め、膵β細胞への強い傷害を示唆する所見を得た。
この結果は本年5月の日本糖尿病学会、および6月の米国糖尿病学会で発表予定であるとともに、知財化のため特許申請済みであり、論文化を行っている途上である。

研究成果

• [国際共同研究] City of Hope National Medical Center(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: City of Hope National Medical Center
  • 他の機関数: 1
• [学会発表] 膵β細胞特異的PCRによる膵β細胞死の検出 (2018)
  • 著者名/発表者名: 黒田暁生、山田美鈴、冨永ゆかり、鈴木麗子、田蒔基行、明比祐子、高士祐一、石津将、古賀大輔、井本逸勢、倉橋清衛、吉田守美子、遠藤逸朗、粟飯原賢一、安倍正博、Kevin Ferreri、松久宗英
  • 学会等名: 第61回日本糖尿病学会年次学術集会
• [学会発表] Detection of pancreatic beta cell DNA in the circulation using the dual Amplification Refractory Mutation System PCR (2018)
  • 著者名/発表者名: Akio Kuroda, Misuzu Yamashita-Yamada, Yukari Tominaga, Reiko Suzuki, Motoyuki Tamaki, Yuko Akehi, Yuichi Takashi, Daisuke Koga, Eisuke Shimokita, Fuminori Tanihara, Kiyoe Kurahashi, Sumiko Yoshida, Itsuro Endo, Ken-ichi Aihara, Masahiro Abe, Kevin Ferreri, Munehide Matsuhisa
  • 学会等名: 78th American Diabetes Association SCIENTIFIC SESSIONS
  • 国際学会
• [産業財産権] 膵β細胞の傷害検査方法 (2018)
  • 発明者名: 黒田暁生、山田美鈴、松久宗英
  • 権利者名: 徳島大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2018-0019