| 研究課題/領域番号 |
15K06926
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
木村 富紀 立命館大学, 薬学部, 教授 (40186325)
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| 研究分担者 |
西澤 幹雄 立命館大学, 生命科学部, 教授 (40192687)
稲葉 宗夫 関西医科大学, 医学部, 非常勤講師 (70115947)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | RIP-RNAseq / RIP-RT PCR / 抗ヒトAgo2抗体 / 抗ヒトHuR抗体 / ヒトインフルエンザウイルス感染 / natural antisense RNA / microRNA / ceRNA ネットワーク |
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| 研究実績の概要 |
1.平成28年度は、前年度に引き続き「RNA-seq法によるゲノムレベルでのasORNのoff-target効果の検討」を継続した。これまでの実験より細胞総RNAを出発材料とした場合、確認できるRNA種は発現頻度が高いHouse keeping mRNA群に限られたことから、発現頻度が低い制御性RNAを個別に検討するには、対象RNA集団の濃縮が必要と考えた。そこで、解析対象とする制御性アンチセンス(as)RNAはmicroRNAにより認識されることを報告していることから、Ago2に対する抗体を用いてRNA immunoprecipitation (RIP)を行い、目的RNA集団の濃縮を図った。陽性対象としてmRNA 3’非翻訳領域に結合し、mRNAの安定化、核外輸送を制御するHuRを採用した。
2.これまで、インターフェロン (IFN)-α1 asRNAが示す遺伝子発現制御機能として、IFN-α1 mRNAの転写後性の安定化作用を報告した。また、この安定化に当たっては同mRNA標的二次構造に対する直接効果と分子囮としてmicroRNAを吸着するcompeting endogenous (ce)RNA効果が作用することを示している。今年度は、IFN-α1 mRNAの安定性制御機構の発現プロファイルの動的解析を目的として、IFN-α1 asRNAが示す二種類の安定化作用を識別し、両作用を定量評価した。加えて、IFN-αスパーファミリーには属さないceRNAとして、本安定性制御機構に関与することを報告した他の細胞mRNAも検討し、本制御機構に果たすceRNA ネットワークを定量評価した。
3.ceRNAやmicroRNAの発現異常が細胞がん化の誘因として注目されることから、がん原性ウイルスや細菌の感染により誘導される病原体由来の制御性RNAが感染性発がんに果たす役割について考証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
1.1) 当初計画にあげた「ヒト末梢血形質細胞様樹状細胞(pDC)を用いた薬効薬理試験」は、細胞数不足から解析可能なRNA量を確保できず、IFN-α1 mRNAシグナル検出の報告があるヒト末梢血単核球（PBMC）に代えた。しかしPBMCが多種細胞集団から成るためか、検出感度でRNAseqを上回るRT-PCRを用いても、解析対象とする制御性asRNAシグナルを検知することが出来なかった。
2) 従って、抗Ago2抗体、抗HuR抗体によるRIP実験にはヒトNamalwa細胞を用い、これ迄に有効抗体の選定、至適細胞数の決定、RNA免疫沈降条件の至適化を終えた。得たRNAサンプルに対し、CAPRIN1とEF mRNAs（前者はceRNAとしてmicroRNAの標的となり、Ago2と複合体を形成する）を相対定量した。その結果、サンプル中のこれらmRNA含有量はRIPにより3-5倍増大したので、混入するrRNAを除去し、RNAseq用RNA検体（最終収量は各抗体由来サンプルあたり100-200ng）準備を完了した。
2.IFN-α1 asRNAが示す直接安定化効果とceRNA効果の定量的識別を可能にした。その結果、IFN-α1 mRNA安定化効果は後者が前者を2-3倍上回り、その作用は後者が長時間持続することを示した。また、IFN-α1 asRNAとCAPRIN1 mRNAのceRNA効果を比較した場合、後者はasRNAの100倍以上発現するにも関わらず、安定化能は10%程度にすぎないことが明らかとなり、ceRNA分子間でmicroRNAの吸着能に大きな相違が存在することが示された。
3.病原体由来の制御性RNAが感染性発がんに果たす役割について、”Pathogen-associated regulatory non-coding RNAs and oncogenesis”を論文発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.1) 厚生労働省の「献血血液の研究開発等での使用に関する指針」により、献血血液（検査等により不適合となった血液あるいは白血球除去工程後のフィルター）の研究用の提供が公募されていることを知ったので、今年度の公募に応募し、ヒト末梢血由来pDC細胞の初代培養系の確立を可能にする量の献血血液サンプルを入手するようにする。
2)上述の申請が認められない場合や、申請が承認されても今年度に十分な研究期間が担保できない場合には、「現在までの進捗状況」1の 2)に記載したヒトNamalwa細胞を代用し、「IFN-α1 mRNAの安定化により宿主自然免疫制御を可能にするasRNA機能ドメイン由来オリゴヌクレオチドの薬効薬理試験」、「RNA-seq法によるゲノムレベルでのasORNのoff-target効果の検討」を実施する。
2.IFN-α1 mRNAの安定性制御機構の解析については、2015年に発表したceRNAネットワークに属する全てのIFN-α mRNA (即ち、α7, α8, α10, α14 mRNAs)とasRNA (即ち、α8, α10, α14, α17 asRNAs)に検討対象を拡大し、同機構の総括的定量解析を完了する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2016年度内にRNAseqの外注が間に合わなかったので、充当を予定していた予算を余剰金として処理した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度研究費残額261,399円は、次年度予算に繰り越して使用を予定する。
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| 備考 |
Frontiers in Bioscience Special Issue on Regulatory long non-coding RNA (2017)
https://www.bioscience.org/special-issue-details?editor_id=1797
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