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2015 年度 実施状況報告書

ミトコンドリアにおける翻訳停滞解消機構およびその不全による病態発現機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 15K06945
研究機関群馬大学

研究代表者

行木 信一  群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80302959)

研究分担者 畑田 出穂  群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (50212147)
研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード翻訳停滞解消因子 / ミトコンドリア / リボソーム
研究実績の概要

蛋白質合成(翻訳)の滞りの解消機構は生物種によって異なる。ミトコンドリアの翻訳系では,2つの翻訳停滞解消因子ICT1及びC12orf65蛋白質が必須であることを示してきたが,どのような翻訳停滞状態が生じ,それに対し2つの因子がどのように役割分担し機能しているのかは未知である。一方,ヒトではC12orf65遺伝子に変異が起こると,その位置により病態の異なるミトコンドリア病を引き起こす。本研究の目的は,①リボソームプロファイリングによりICT1あるいはC12orf65依存的に解消される翻訳停滞解消状態(配列)を明らかすることで,「翻訳停滞解消機構」の全容を示し,②CRISPR/Casゲノム編集法によりC12orf65の欠損領域が異なるマウスを複数作製し解析することで,解消機構不全によるミトコンドリア病の病態発現機構を解明することである。
今年度は,CRISPR/Casゲノム編集法によるC12orf65欠損マウスを作製を集中的に行った。CRISPR/Cas法とは,2本鎖DNA切断とDNA修復のエラーを利用したゲノム編集で,目的の遺伝子のDNA2本鎖切断後に偶発的に起こる塩基の挿入欠失によるフレームシフト変異により,正常な蛋白質発現を不可能にしている。すでに報告されているミトコンドリア病患者で起きているフレームシフトに相当する変異を,マウスゲノムで起こさせるようにgRNAを設計した(3種類)。現在,前段階として,マウスのES細胞に対してこれらのgRNAがゲノム編集を起こしているか確認した。その結果,設計した一つのgRNA配列が有効に機能していた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ノックアウトマウスを作製するゲノム編集法の過程で,培養細胞の段階は,1つのgRNA配列ではあるが成功したと考えられるので,(2)と判断した。それ以外の実験が進まなかった点がマイナス評価である。

今後の研究の推進方策

ゲノム変異が異なる複数のマウスを作製を目標としているので,gRNAの配列を変更し再度ES細胞を使ってゲノム編集を試みる。成功したもの関しては,共同研究者と共にマウスの受精卵へのマイクロインジェクションを試み,ノックアウトマウスの作製を行う。
また,他の予定されている実験(二次元電気泳動,リボソームプロファイリング)を行う。

次年度使用額が生じた理由

設備備品としてCO2インキュベーターを計上していたが,共同にて別途早期に購入されたので,本費用で購入する必要がなくなってしまったため。

次年度使用額の使用計画

次年度,消耗品として使用する予定。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2016 2015 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Kawamura,T., Hirata, A., Ohno, S., Nomura, Y., Nagano, T, Nameki, N., Yokogawa, T. and Hori, H.2016

    • 著者名/発表者名
      Multisite-specific archaeosine tRNA-guanine transglycosylase (ArcTGT) from Thermoplasma acidophilum, a thermo-acidophilic archaeon
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Research

      巻: 44 ページ: 1894-1908

    • DOI

      10.1093/nar/gkv1522. Epub 2015 Dec 31.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Stalled-ribosome rescue factors are essential for mitochondrial function.2015

    • 著者名/発表者名
      Shizuka Kobayasi, Akihiko Murasato, Sho Arai, Hiroyuki Kogure, Takuro Horii, Izuho Hatada and Nobukazu Nameki
    • 学会等名
      2nd International Symposium of Gunma University Medical Innovation (GUMI2015)
    • 発表場所
      群馬大学昭和キャンパス(群馬県)
    • 年月日
      2015-12-08 – 2015-12-08
    • 国際学会
  • [学会発表] 酵母におけるミトコンドリア翻訳停滞解消因子の欠損株を用いたFlow Cytometry解析2015

    • 著者名/発表者名
      五月女侑洋,井上楓音,今井友紀,行木信一
    • 学会等名
      第9回日本ゲノム微生物若手の会
    • 発表場所
      八王子セミナーハウス(東京都)
    • 年月日
      2015-09-29 – 2015-09-30
  • [学会発表] ミトコンドリアにおける翻訳停滞解消機構の解明2015

    • 著者名/発表者名
      村里旺彦,小暮裕幸,堀居拓郎,浅川直紀,畑田出穂,行木信一
    • 学会等名
      平成27年度日本生化学会関東支部例会
    • 発表場所
      新潟日報メディアシップ(新潟県)
    • 年月日
      2015-06-20 – 2015-06-20
  • [備考] 行木研ホームページ

    • URL

      http://molbio.chem-bio.st.gunma-u.ac.jp/

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公開日: 2017-01-06  

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