| 研究課題/領域番号 |
15K06949
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
堀江 朋子 (川俣朋子) 東京工業大学, フロンティア研究機構, JSPS特別研究員 (70435527)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | オートファジー / 核酸 / RNA / RNase / 輸送 / 液胞 / 代謝 / RNA分解 |
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| 研究実績の概要 |
オートファジーは広く保存された細胞内の分解システムであり、それによりタンパク質と匹敵する量のRNA が分解されることが示唆されていたが、RNA 分解の分子機構は長らく不明であった。しかし、申請者自身による酵母を用いた解析から、オートファジー依存的なRNA 分解の全体像について、関与する遺伝子群の同定等により少しづつ解明されつつある。本研究の目的であるオートファジーに依存して分解されるRNA種をプロファイリングするためには、変異体と細胞生物学的手法を駆使してRNAを単離する系を確立する系が不可欠である。初年度はまず、オートファジー誘導条件下で液胞を単離し、液胞内のRNase活性を生化学的に再現すること、および液胞からRNAを精製するための最適な条件を検討することを試みた。
その結果、単離した液胞にはエンドリボヌクレアーゼであるRny1に依存したRNase活性があることを確認した。Rny1は非常に高い活性をもつことも生化学的に明らかにした。そのため、オートファジーに由来する単離液胞内のRNAの解析をするためにはrny1の破壊株で行う必要があることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
まず、液胞を生化学的に単離するところに相当な時間を要した。現在広く使われている液胞単離のメソッドは、液胞膜タンパク質の精製を目的としている。今回の目的、すなわち液胞の中身を忠実に保ったまま、なおかつ高純度に精製することは、現在のメソッドでは不十分であり、かなりの条件検討が必要であった。
上記に加えて、単離液胞内に存在するRNaseであるRny1は、低濃度であっても活性が非常に高いため、野生型ではRNAの部分的な分解産物を生化学的に精製することが困難であった。この結果は、単に野生株とオートファジー遺伝子破壊株から液胞を単離するよりも、rny1破壊株とrny1破壊株とオートファジー遺伝子破壊株の二重変異体由来の液胞に含まれるRNAを高解像度で解析する必要があることを示している。よって次年度にはその条件下でRNAを単離し含まれるRNAをプロファイリングする予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
もう一つのテーマとして設定しているRNA分解産物（ヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオベース）の輸送経路について、液胞膜および細胞膜に存在すると考えられる輸送体をデータベースから検索し、候補因子の破壊株において、細胞内、細胞外の核酸分解代謝物を測定することにより、輸送体を同定する実験もスタートしていきたいと考えている。
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